牡蒿提取物抗氧化作用和遺傳毒性研究

1 材料與方法

1.1 實驗材料

3月份采集剛萌發的牡蒿幼嫩莖葉,采摘地點為六安市裕安區東河口鎮丘陵地區。

1.2 主要儀器與試劑

數顯恒溫水浴鍋 (HH-4型),顯微鏡 (SB-200型),紫外可見分光光度計 (TU-1201型),菲利浦榨汁機,高速組織攪碎機 (DS-1型),離心機 (TDL-40B型),旋轉蒸發器 (RE-52D),數顯電熱鼓風干燥箱(101A5-2型),超聲波細胞粉碎機 (JY92-Ⅱ)。LPS為美國 Sigma公司產品,BCG系國家衛生部上海生物制品研究所產品。MDA、GSH-Px、SOD試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。環磷酰胺 (cyclophosphamide,CP)由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產。

1.3 試驗動物

清潔級昆明種小鼠,體重 18～22 g,由安徽醫科大學實驗動物中心提供,皖醫實動準第 02號。在恒溫 (22℃)、相對濕度 65%～70%、光照周期 12 h∶12 h,自由進食標準顆粒型動物飼料,飲自來水,適應飼養 1周后開始實驗。

1.4 牡蒿提取物制作

新鮮牡蒿莖葉,洗凈,烘干,研細。稱取 10份,每份 20 g,每份加蒸餾水 100 mL,超聲波頻率 20 kHz(100 W),處理 10 min,浸泡過夜,加熱回流提取,濾紙過濾除去不溶物質,提取液減壓濃縮,合并濃縮液,調節牡蒿提取物 (Artem isia japonicaExtract,AJE)濃度為 50 mg/mL。試驗前用蒸餾水配制成各劑量組灌胃給藥。

1.5 抗氧化實驗

1.5.1 動物模型復制

復制模型第 1 d給小鼠經尾靜脈注射 BCG2.5 mg/mL(約含 5×105個活菌數),10 d后再次尾靜脈注射 LPS 7.5μg(0.2 mL)。

1.5.2 動物分組及處理

30只昆明種小鼠 (雌雄各半,體重 18～22 g)隨機分為 5組,每組 6只,分別為陰性對照組,模型組,AJE低、高劑量組 (40,250 mg/kg)和陽性對照組(聯苯雙酯 (bifendate,Bif)100 mg/kg)。用藥方案:從模型復制第 1天起,分別灌胃不同劑量 AJE,Bif,陰性對照組和模型組給予等量蒸餾水,每天 1次,連續灌胃 30 d。第 31 d殺鼠取肝臟制備肝勻漿。

1.5.3 指標檢測及方法

MDA、GSH-Px和 SOD測定按試劑盒說明書進行。

1.6 骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

24只昆明種小鼠 (雌雄各半,體重 18～22 g)隨機分為 4組,每組 6只,分別為陰性對照組 (蒸餾水),AJE低、高劑量組 (40、250 mg/kg體重)和陽性對照組 (環磷酰胺 (CP)40 mg/kg)。每天 1次 AJE,連續灌胃 30 d,環磷酰胺為腹腔注射,第 31 d處死動物,制取胸骨骼液,涂片,染色,鏡檢嗜多染紅細胞(PCE),每鼠計數 1000個嗜多染紅細胞的微核率(MNF),以 ‰表示[7]。

1.7 精子畸形試驗

24只雄性昆明種小鼠 (體重 18～22 g)隨機分為 4組,每組 6只,分別為陰性對照組 (蒸餾水),AJE低、高劑量組 (40、250 mg/kg體重)和陽性對照組 (環磷酰胺,40 mg/kg)。灌胃給予AJE(環磷酰胺為腹腔注射),連續 30 d,繼之飼養 30 d,自由攝食,飲水,于 61 d頸椎脫臼處死,取雙側附睪,置生理鹽水中充分剪碎,濾除組織碎片,制成精子懸液,常規涂片,甲醇固定,2%伊紅染色,于 10×40倍顯微鏡下觀察形態。每只動物觀察 1000個精子,精子畸形的類型有:無頭、無鉤、無定形、香蕉形、雙頭和雙尾以及胖頭等。記錄畸形精子數,計算精子畸形率[8]。

1.8 統計學方法

方差分析采用 SPSS10.0軟件,數據以±s表示,組間比較采用 LSD檢驗。

2 結果與分析

2.1 牡蒿提取物對小鼠肝組織中 MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響

各試驗組小鼠肝勻漿 MDA含量及 SOD和GSH-Px活性測定結果見表 1。

表1 牡蒿提取物對小鼠肝組織中MDA含量及 SOD和 GSH-Px活性的影響(n=6,±s)Table 1 The effects ofAJE on the contents of Serum MDA and the activities of SOD and GSH-Px(n=6,±s)

注:與陰性對照組比較,##P＜0.01;與模型組比較,＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。Note:Compared with Negative control,##P＜0.01;Compared withModel group,＊P＜0.05,＊＊P＜0.01

組別Group MDA含量(nmol/mg)SOD含量(U/mg)GSH-Px含量(U/mg)陰性對照組 Negative control(Water) 6.45±1.42 276.64±43.20 137.48±27.45模型組 Model group(BCG2.5mg/mL+LPS7.5μg) 17.65±3.34## 179.38±35.43## 93.24±21.25##低提取物組 AJE(40 mg/kg) 14.43±2.18 211.62±34.25 110.73±24.15高提取物組 AJE(250 mg/kg) 9.03±1.02＊＊ 268.32±43.32＊＊ 131.52±24.31＊陽性對照組 Bif(100 mg/kg) 9.01±2.37＊＊ 192.21±39.22 106.41±20.57

與陰性對照組比較,模型組肝勻漿 MDA水平顯著升高(P＜0.01),同時 SOD,GSH-Px水平顯著降低 (P＜0.01)。與模型組比較,AJE低、高劑量組和Bif組肝勻漿MDA水平均顯著降低,SOD水平和GSH-Px水平顯著升高。其中,AJE高劑量組和 Bif的MDA差異具有顯著性 (P＜0.01),AJE高劑量組的 SOD和 GSH-Px差異具有顯著性 (P＜0.01)。說明 AJE高劑量組有降低 MDA和升高 SOD和 GSHPx的作用,其抗氧化作用明顯。

2.2 骨髓嗜多染紅細胞微核率

陰性對照組、AJE各劑量組和陽性對照組的骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果見表 2。

表2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果(n=6,±s)Table 2 Results ofmicronucleus test of bone marrow PCE cells in mice(n=6,±s)

注:與陽性對照組比較,＊＊P＜0.01。Note:Compared with CP,＊＊P＜0.01

組別Group嗜多染紅細胞PCE微核率MNF(‰)陰性對照組 Negative control(Water) 6000 2.4±0.77＊＊低提取物組 AJE(40 mg/kg) 6000 2.5±0.61＊＊高提取物組 AJE(250 mg/kg) 6000 2.1±0.42＊＊陽性對照組 CP(40 mg/kg) 6000 25.5±0.9

由表 2可知,AJE各劑量組和陰性對照組的微核率為 2.1‰～2.5‰。統計學檢驗表明,各劑量組與陰性對照組比較及各劑量組間比較,微核率差異均無統計學意義 (P＞0.05),而陽性對照組與陰性對照組和各劑量組比較,微核發生率差異有統計學意義 (P＜0.01)。

2.3 精子畸形率

陰性對照組、AJE各劑量組和陽性對照組的精子畸形試驗結果見表 3。

表3 小鼠精子畸形試驗結果(n=6,±s)Table 3 Results of sper mabnormality test ofmice(n=6,±s)

注:與陽性對照組比較,＊＊P＜0.01。Note:Compared with CP,＊＊P＜0.01

組別Group Mice精子數Sperms畸形精子Aberrated sperms精子畸形率Frequencies of abnor mality(%)陰性對照組 Negative control(Water) 6000 76 1.26＊＊低提取物組 AJE(40 mg/kg) 6000 84 1.40＊＊高提取物組 AJE(250 mg/kg) 6000 70 1.16＊＊陽性對照組 CP(40 mg/kg) 6000 544 9.06

由表 3可知,AJE各劑量組和陰性對照組的精子畸形率在 1.16%～1.40%之間。各劑量組與陰性對照組比較及各劑量組間比較,精子畸形率差異均無統計學意義 (P＞0.05),而陽性對照組與陰性對照組和各劑量組比較,精子畸形率差異有統計學意義 (P＜0.01)。

3 結論

3.1 通過對 AJE成分分析,發現含有豐富的黃酮、多酚和多糖等抗氧化類物質。因此在 AJE制作時,以提取液中黃酮、多酚和多糖含量等為綜合指標,對超聲波頻率和處理時間、料水比和加熱溫度等因素進行正交試驗,制取抗氧化成分含量更高的 AJE。另外,用蒸餾水做提取液有利于放大為規模化工業生產、環保,并可直接用于食品及藥品的開發利用。

3.2 本研究以 2種不同劑量 AJE對模型小鼠體內試驗,結果表明高劑量組 AJE具有減少MDA生成,提高 SOD和 GSH-Px活性,增加其抗氧化能力。在對AJE成分分析時發現[3],AJE含豐富的類黃酮、多糖、多酚類、皂苷類類、青蒿素和揮發油等化合物。因此,AJE的抗氧化作用可能是多種活性成分共同作用的結果。小鼠骨髓微核試驗和精子畸形試驗,結果均為陰性,說明在一定劑量范圍內,AJE對人體是安全的,對機體無遺傳毒理活性作用。

3.3 牡蒿是許多地區常見野菜,食用歷史悠久,其AJE具有抗氧化性,無遺傳毒理活性,營養豐富,香味濃郁,無污染,食用安全,可作為天然飲料或食品添加劑的原料,具有較高的應用潛力和綜合開發前景。

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Antioxidation and Genetic Toxicity ofA rtem isia japonicaExtract

ZHANGDe-hua＊,CHENG Peng-fei,L INGLing
Department of Chem istry and L ife Science,W est Anhui University,Liu’an 237012,China

R285.5;Q946.91

1001-6880(2011)01-0039-04

2010-04-16 接受日期:2010-07-05

安徽省高校省級自然科學基金重點項目(KJ2008A15ZC)

＊通訊作者 Tel:86-564-3329262;E-mail:zdhla@163.com