膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠抗氧化能力和血脂代謝的影響

李亞欣,施用暉1,,王潔昀,林云鑒,樂國偉1,＊1>

1江南大學食品科學與技術國家重點實驗室;2江南大學食品學院,無錫 214122

膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠抗氧化能力和血脂代謝的影響

李亞欣2,施用暉1,2,王潔昀2,林云鑒2,樂國偉1,2＊1>

1江南大學食品科學與技術國家重點實驗室;2江南大學食品學院,無錫 214122

本文探討膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠抗氧化能力及血脂代謝的影響。40只小鼠隨機分為 5組 (n=8):分別飼喂正常日糧,高脂日糧,添加 0.5%和 1%膠原蛋白肽及 0.1%硫辛酸的高脂日糧。42 d后測定小鼠全血(血清)和組織活性氧 (Reactive oxygen species,ROS)水平、丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)含量、抗氧化酶活力及血脂水平。結果表明:0.5%和 1%膠原蛋白肽都可顯著降低機體 ROS水平及MDA含量 (P＜0.05),增強抗氧化能力 (P＜0.05),改善血脂水平(P＜0.05)。1%膠原蛋白肽能使機體抗氧化能力及血脂水平恢復到正常水平,0.5%的添加量效果不顯著。適量的膠原蛋白肽可有效提高機體抗氧化能力,緩解高脂膳食造成的氧化應激,改善血脂代謝。

膠原蛋白肽;硫辛酸;高脂日糧;氧化應激;抗氧化能力;血脂代謝

Abstract:The effects of collagen peptides on antioxidant capacity and serumlipid metabolism of mice fed with high-fat dietwere studied in the presentwork.Fortymicewere randomly divided into 5 groups.Theywere fedwith ordinary diet,high-fat diet,and high-fat dietwith 0.5%collagen peptides,1%collagen peptides,and 0.1%lipoic acid,respectively.The level of reactive oxygen species(ROS),contents ofmalondialdehyde(MDA)and antioxidant enzymes activities in blood(serum)and tissues and serumlipid levelwere determined after 42 days.The results showed that both 0.5%and 1%collagen peptides could remarkably decrease the levels of ROS and the contents ofMDA,enhance the antioxidant capacity ofmice,aswell as improve the levelof serumlipid.The antioxidant capacity and serumlipid level could recover to normal levelwhen 1%collagen peptideswas added to high-fat diet.However,there were no significant effects in 0.5%collagen peptides group.These results indicated that the appropriate collagen peptides could effectively enhance antioxidant capacity,relieve oxidative stress caused by high-fat diet and improve serumlipid metabolis m.

Key words:collagen peptides(CP);lipoic acid(LA);high-fat diet;oxidative stress;antioxidant capacity;serumlipid metabolis m

大量研究表明,營養失衡,長期攝入高脂食物使自由基過量生成,機體氧化還原平衡被打破,引起脂質過氧化、DNA和蛋白質的氧化損傷,誘發脂代謝紊亂、肥胖或糖尿病等疾病[1]。機體氧化應激時,金屬基質蛋白酶的表達與分泌急劇提高,降解基質中的膠原蛋白,釋放出大量的膠原蛋白肽[2]。膠原蛋白肽具有抗氧化、抑制血壓上升、減緩動脈硬化和預防骨質疏松等功能[3],機體釋放的膠原蛋白肽可能通過發揮抗氧化作用來緩解氧化應激造成的損傷。目前,關于外源補充膠原蛋白肽緩解機體氧化應激的研究未見報道。因此,本試驗通過建立高脂動物模型誘導機體氧化應激,研究膠原蛋白肽的體內外抗氧化能力及其對機體血脂代謝的影響,為膠原蛋白肽作為功能性抗氧化劑提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

實驗室自制豬骨膠原蛋白肽,相對分子量 89%集中在 150～1200 Da,羥脯氨酸占總氨基酸的26.22%;硫辛酸 (純度 99%),江蘇常熟富士萊醫藥化工有限公司;總抗氧化能力 (TAC)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛 (MDA)、脂蛋白脂酶 (LPL)和肝脂酶 (HL)試劑盒,南京建成生物工程研究所;總膽固醇 (TC)、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)和甘油三酯 (TG)試劑盒,中生北控生物科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

低溫高速離心機 (上海安亭科學儀器廠);超低溫冷凍冰箱 (美國 INVETRO);UV1100紫外可見分光光度計 (北京瑞利科學儀器有限公司);MPI-B型多參數化學發光檢測儀 (西安瑞邁分析儀器公司)。

1.3 方法

1.3.1 硫辛酸和膠原蛋白肽體外抗氧化能力的比較

硫辛酸和膠原蛋白肽對 DPPH·自由基的清除能力參照 Brand-W illiams[4]提出的方法測定;對·OH自由基的清除能力用水楊酸法測定[5];對ABTS·自由基的清除能力參照 Erkan[6]提出的方法測定。

1.3.2 動物實驗設計

40只 4周齡清潔級雄性昆明種小鼠 (上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供),體重約 (18±2)g。飼喂正常日糧 7 d后,根據體重隨機分為 5組:①正常組 (Control);②高脂模型組 (high-fat diet,HFD);③高脂 +0.5%CP組 (HFD+0.5%CP);④高脂 +1%CP組 (HFD+1%CP);⑤高脂 +0.1%LA組(HFD+0.1%LA),正常日糧和高脂日糧配方如表 1所示。小鼠同室分籠飼養,自然光照,自由采食和飲水。環境溫度控制在 (23±2)℃,濕度 60%,飼養42 d。

表1 日糧組成[7](g/100 g)Table 1 Composition of diet(g/100 g)

1.3.3 實驗樣本的制備

實驗結束后禁食 12 h,摘眼球取血分離血清 (3000 r/min,10 min)。斷頸椎處死小鼠,迅速稱取肝臟、腎臟和十二指腸以預冷的生理鹽水為勻漿介質制成 10%組織勻漿,3000 r/min離心 10 min后取上清液待測。上清液的蛋白質含量用考馬斯亮藍法測定[8]。

1.3.4 指標的測定

全血和組織 ROS水平參照 Luminol化學發光法[9,10]測定。

血清和組織勻漿總抗氧化能力 (TAC)、過氧化氫酶 (CAT)、丙二醛 (MDA)按照試劑盒說明書測定;組織勻漿超氧化物歧化酶 (SOD)活力采用鄰苯三酚自氧化法[11]測定;全血和組織勻漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力采用 DTNB直接顯色法[12]測定。血清總膽固醇 (TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、甘油三酯(TG)、脂蛋白脂酶 (LPL)和肝脂酶 (HL)按照試劑盒說明書測定。動脈粥樣硬化指數 A I=(TCHDL-C)/HDL-C[13]。

1.4 數據分析

實驗數據用 spss13.0軟件進行方差分析和多重比較,結果±s表示。

2 結果與分析

2.1 硫辛酸和膠原蛋白肽體外抗氧化能力的比較(圖1)

圖1是濃度為 0.1～0.5 mg/mL的硫辛酸和濃度為 1～5 mg/mL的膠原蛋白肽對 DPPH·,·OH和ABTS+·自由基的清除情況。當膠原蛋白肽濃度為硫辛酸 10倍時才能達到與硫辛酸相當的自由基清除率。動物實驗中以添加 0.1%硫辛酸作為陽性對照[14],故本試驗膠原蛋白肽選擇 1%和 0.5%兩個劑量研究膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠抗氧化能力和血脂代謝的影響。

圖1 硫辛酸 (a)和膠原蛋白肽 (b)對 DPPH·,·OH和 ABTS+·自由基的清除能力Fig.1 Scavenging activities of lipoic acid(a)and collagen peptides(b)on DPPH·,·OH and ABTS+· radicals

2.2 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠全血和組織 ROS水平的影響 (表 2)

從表 2可知,高脂模型組小鼠 ROS水平顯著升高 (P＜0.05)。高、低劑量膠原蛋白肽組 ROS水平均顯著低于高脂模型組 (P＜0.05)。1%膠原蛋白肽能有效清除機體過量的 ROS,維持自由基在正常水平,與正常組相比無顯著差異 (P＞0.05)。

表2 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠全血 (cd/μL)和組織 (cd/mg tissue)ROS水平的影響Table 2 Effects of collagen peptides on the level of ROS in blood(cd/μL)and tissues(cd/mg tissue)ofmice fed with high-fat diet

2.3 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠全血 (血清)抗氧化能力的影響 (表 3)

表3是膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠全血 (血清)抗氧化能力的影響。高、低劑量膠原蛋白肽都能顯著提高全血 (血清)TAC、CAT和 GSH-Px的活性 (P＜0.05),顯著降低 MDA的含量 (P＜0.05);1%膠原蛋白肽組與 0.1%硫辛酸組一樣都能使全血 (血清)抗氧化能力恢復到正常水平。

表3 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠全血 (血清)抗氧化能力的影響Table 3 Effects of collagen peptides on antioxidant capacity in blood(serum)ofmice fed with high-fat diet

2.4 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠組織抗氧化能力的影響 (表 4)

如表 4所示,高脂模型組同正常組相比各指標均存在顯著差異 (P＜0.05)。高、低劑量膠原蛋白肽都能顯著提高組織 TAC、CAT、GSH-Px和 SOD的活性 (P＜0.05),顯著降低 MDA的含量 (P＜0.05)。1%膠原蛋白肽與 0.1%硫辛酸都能使組織抗氧化能力恢復到正常水平。

表4 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠組織抗氧化能力的影響Table 4 Effects of collagen peptides on antioxidant capacity in tissues ofmice fed with high-fat diet

2.5 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠血脂代謝的影響(表5)

表5是膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠血脂代謝的影響。高脂模型組同正常組血脂指標存在顯著差異(P＜0.05)。高、低劑量膠原蛋白肽均能顯著降低血清 TC、LDL-C和 TG的含量 (P＜0.05),顯著增加HDL-C的含量 (P＜0.05)。1%膠原蛋白肽組與0.1%硫辛酸組都能顯著改善高脂日糧導致的血脂代謝紊亂,與正常組相比無顯著差異 (P＞0.05)。

表5 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠血脂代謝的影響(mmol/L)Table 5 Effects of collagen peptides on lipid metabolis min serum ofmice fed with high-fat diet(mmol/L)

2.6 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠血清 LPL和 HL的影響 (圖 2)

由圖 2可知高脂日糧能顯著降低小鼠血清LPL和 HL的活性 (P＜0.05),顯著提高 A I(P＜0.05),高、低劑量膠原蛋白肽均能夠顯著提高 LPL和 HL的活性 (P＜0.05),顯著降低 A I(P＜0.05)。1%膠原蛋白肽與 0.1%硫辛酸都能使血清 LPL和 HL的活性及A I恢復到正常水平。

圖2 膠原蛋白肽對高脂日糧小鼠血清 LPL和 HL活性 (U/mL)(a)及 A I(b)的影響Fig.2 Effects of collagen peptides on the activities ofLPL and HL in serum(U/mL)(a)and A I(b)ofmice fed with high-fat diet

3 討論

膠原蛋白是機體重要的結構蛋白質,許多生理活動如骨形成和代謝、皮膚膠原代謝等都需要膠原蛋白的參與。在膠原蛋白羥脯氨酸的形成過程中,Vc維持著脯氨酰羥化酶和賴氨酰羥化酶的活性,羥脯氨酸的抗氧化功能可能來自于脯氨酸和賴氨酸的羥基化過程中Vc抗氧化能力的轉移。體內羥脯氨酸游離的 4-羥基能清除超氧自由基和羥自由基,具有抗氧化功能[15],從而將抗氧化能力貯備在膠原蛋白中。本試驗室制備的膠原蛋白肽羥脯氨酸含量占總氨基酸的 26.22%,1%膠原蛋白肽體外清除自由基的能力與 0.1%硫辛酸相當。體內試驗研究表明膠原蛋白肽能顯著降低高脂日糧小鼠機體 ROS水平及脂質過氧化產物MDA的含量,提高抗氧化酶活性,從而提高機體的抗氧化能力。同時,膠原蛋白肽的抗氧化能力存在劑量關系,0.5%膠原蛋白肽在一定程度上能提高機體的抗氧化能力;而 1%膠原蛋白肽與 0.1%硫辛酸一樣都能使機體抗氧化能力恢復到正常水平,說明膠原蛋白肽具有較強的抗氧化作用。

長期的高脂膳食導致機體氧化應激,ROS水平和MDA含量顯著提高,阻礙了線粒體對脂肪酸的氧化產能,血液中脂肪酸的水平急劇升高,導致脂肪酸調節失衡,血脂代謝異常,LPL和 HL的活性降低,A I升高。而高水平的LDL-C和低水平的 HDL-C是引起動脈粥樣硬化的重要誘因[16],LPL和 HL活性的降低會導致血漿乳糜微粒和脂蛋白的代謝障礙,誘發高脂血癥和動脈粥樣硬化[17]。本試驗研究證明;膠原蛋白肽通過發揮抗氧化作用,有效地改善了氧化還原狀態的失衡,從而提高了 LPL和 HL的活性,降低了 A I,顯著改善了血脂代謝。不同劑量的膠原蛋白肽提高機體抗氧化能力的程度不同,改善血脂代謝的效果也存在差異。1%膠原蛋白肽和0.1%硫辛酸效果相當,都能使血脂水平恢復到正常狀態,而 0.5%膠原蛋白肽調節血脂代謝的效果不及 1%膠原蛋白肽。

綜上所述,膠原蛋白肽能有效清除機體自由基,增強機體抗氧化能力,從而改善血脂代謝。

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Effects of Collagen Peptides on Antioxidant Capacity and Serum Lipid Metabolism of Mice Fed with High-fatDiet

LI Ya-xin2,SH I Yong-hui1,2,WANG Jie-yun2,LIN Yun-jian2,LE Guo-wei1,2＊

1State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University;2School of Food Science and Technology,Jiangnan University,W uxi 214122,China

R151.2;R285

A

1001-6880(2011)01-0054-06

2009-04-03 接受日期:2009-06-25

十一五“863項目”:蛋白質的定向酶解及生物活性肽富集純化研究(2007AA0Z325);國家科技支撐計劃課題:抗氧化功能食品的研究與產業化(2006BAD27B06)

＊通訊作者 Tel:86-510-85917789;E-mail:lgw@jiangnan.edu.cn