白木香內生真菌Aspergillussp.A14的揮發性成分及其抗菌活性

彭 可,梅文莉,吳 嬌,戴好富＊

1中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所,海南省黎藥資源天然產物研究與利用重點實驗室;2海口市熱帶天然產物研究與利用重點實驗室,海口 571101

白木香內生真菌Aspergillussp.A14的揮發性成分及其抗菌活性

彭 可1,2,梅文莉1,2,吳 嬌1,2,戴好富1,2＊

1中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所,海南省黎藥資源天然產物研究與利用重點實驗室;2海口市熱帶天然產物研究與利用重點實驗室,海口 571101

通過溶劑萃取法提取白木香內生真菌A14(Aspergillussp.)的揮發油,采用濾紙片瓊脂擴散法分別測定了其對 3種人體病原菌的體外抑菌活性。結果表明:A14揮發油對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)和白色念珠菌 (Candida albicans)均表現出一定抑制作用。應用 GC-MS技術,分析鑒定了內生真菌A14揮發油的 14個化學成分,顯示蜂蜜曲菌素是其中的主要成分,占揮發油峰面積的 93.41%。

白木香;曲霉;內生真菌;揮發油;抗菌活性;GC-MS

Abstract:The volatile oils of endophytic fungusA14(Aspergillussp.)fromAquilaria sinensiswere extracted by solvent method and their antimicrobial activities against 3 pathogenswere tested by agar disc diffusion method.The results indicated that the volatile oilsofA14 exhibitedweak antimicrobial activities againstStaphylococcus aureus,Methicillin-resistantS.aureus(MRSA)aswell asCandida albicans.Fourteen ingredients were identified from the volatile oil ofA14 by GC-MS analysis,and mellein was the main component,which accounted for 93.41%of the peak area.

Key words:Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg;Aspergillus;Endophytic fungus;Volatile oil;Antimicrobial activities;GC-MS又被稱為沉香,是一種傳統的名貴藥材和天然香料,具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效[2]。自20世紀 80年代起,我國學者對白木香化學成分的研究主要集中于其產香的樹脂部位[3,4],據報道,其主要成分為倍半萜、2-(2-苯乙基)色酮和三萜類化合物。近年來,對健康白木香的葉、種子以及花和果實等也進行了一些相關研究[5-7]。但到目前為止,對白木香內生真菌的研究仍十分欠缺。

本研究組[8]曾報道過兩株枝頂孢霉屬白木香內生真菌的揮發油成分,發現其均以油酸、亞油酸、棕櫚酸等脂肪酸為主,并含有 1,8-桉葉油素、姜烯、芳姜黃烯等活性萜類成分。A14為本研究組分離自白木香木質部樹脂部位的另一株內生真菌,鑒定為曲霉屬 (Aspergillussp.)真菌。本實驗通過溶劑萃取

近年來,內生真菌的次生代謝產物研究發展迅速,已經分離得到生物堿、甾體、萜類、醌類、木脂素等多種類型化合物,并多具有抗菌、抗腫瘤、促進宿主植物生長、生物防治等藥理和生物活性[1]。但目前對內生真菌揮發油成分的研究少有報道,而揮發油中通常含有具藥理或生物活性的化合物。

白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg]別名土沉香、女兒香、莞香,為瑞香科 (Thymelaeaceae)沉香屬 (Aquilaria)植物,是一種熱帶亞熱帶常綠喬木,主產于海南、廣東、廣西等省區。白木香含樹脂的木材法提取了內生真菌 A14的揮發油化學成分,采用濾紙片瓊脂擴散法測定了其對 3種人體病原菌的體外抑菌活性,并應用 GC-MS技術,分析鑒定了內生真菌A14揮發油的各化學成分及其相對百分比含量。本次研究進一步完善了對白木香內生真菌揮發油成分的研究,為白木香內生真菌的開發利用提供了科學依據。

1 實驗材料

1.1 供試材料

白木香內生真菌 A14由本實驗室從白木香木質部的樹脂部位分離獲得。白木香木質部樣品于2007年 8月采自海南省定安縣,白木香 [Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg]植物由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術所代正福副研究員鑒定,標本編號為AS20070825,保存在中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所。A14經顯微形態觀察,由本實驗室鑒定為曲霉屬 (Aspergillussp.)真菌。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖液體培養基 (PDL):馬鈴薯 20%(取汁),葡萄糖 2%,1×105Pa滅菌 25 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 (PDA):在馬鈴薯葡萄糖液體培養基中加入 2%瓊脂,1×105Pa滅菌 25 min。

1.3 供試病原菌

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (Methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)ATCC 9551由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所洪葵教授提供;金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)ATCC 51650和白色念珠菌 (Candida albicans)ATCC 10231均購于海南省藥品檢驗所。S.aureus和MRSA采用 NA培養基,C.albicans采用 YPD培養基。

1.4 儀器

HP6890/HP5973 GC/MS毛細管氣相色譜-質譜聯用儀 (美國惠普公司)。

2 實驗方法

2.1 白木香內生真菌的培養

從試管保藏斜面挑取適量菌種 A14,接種于PDA平板上活化,在長出的菌落邊緣取直徑 3 mm的菌絲塊,轉接到裝有 300 mL PDL的 1 L搖瓶中,160 r/min搖床培養 7 d。

2.2 揮發油的提取

將所得發酵液過濾棄去沉淀,取上清液備用。采用溶劑萃取法,上清液用正己烷于室溫下浸提三次,減壓蒸去正己烷,再用乙醚溶解,12000 r/min離心 10 min,過濾棄去沉淀,取上清液,回收乙醚后得到褐色油狀物。揮發油的得率為 0.84 mL/L。

2.3 抑菌活性測定

采用濾紙片瓊脂擴散法測定樣品的抗菌活性。將樣品配成質量濃度為 100 mg/mL的甲醇溶液,取樣品溶液 25μL滴加于直徑為 6 mm的滅菌濾紙片上,待溶劑揮干后,將已點樣的濾紙片貼于已涂供試菌懸液 100μL(菌液濃度 105cfu/mL～107cfu/mL)的平板上,放置 20 min后,S.aureus和MRSA放入培養箱中 37℃無光照培養,C.albicans在常溫下培養,24 h后觀察并測量抑菌圈直徑。每個樣品做 3個重復,同時以甲醇試劑為陰性對照,以硫酸卡那霉素為S.aureus和 MRSA的陽性對照,以氟康唑為C.albicans的陽性對照。

2.4 成分測定

氣相色譜條件:色譜柱為 HP-Innowax Polyethylene Glycol(30.0 m ×320μm ×0.25μm)彈性石英毛細管柱,柱溫 50℃ (保留 2 min),以 4℃.min-1升溫至 230℃,保持 20 min;汽化室溫度 250℃;載氣為高純 He(99.999%);柱前壓 5.08 psi,載氣流量2.0 mL.min-1;進樣量 1μL(正己烷溶液);分流比40:1。質譜條件:離子源為 EI源;離子源溫度 230℃;四極桿溫度 150℃;電子能量 70 eV;發射電流34.6μA;倍增器電壓 1925 V;接口溫度 280℃;質量范圍 10～500 amu。

數據處理及質譜檢索:通過 HPMSD化學工作站,結合 Nist2005標準質譜圖庫和W ILEY275質譜圖庫進行鑒定,采用色譜峰面積歸一化法計算相對含量。

3 結果與分析

3.1 抑菌活性

白木香內生真菌 A14的揮發油對S.aureus、MRSA以及C.albicans均表現出一定抑制作用。結果見表 1。

表1 白木香內生真菌A14揮發油的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of the volatile oils ofA14 fromA.sinensis

＊濾紙圓片直徑為 6 mm(The diameter of sterile filter paper discs was 6 mm)

3.2 揮發油成分及相對含量

應用 GC-MS技術,對白木香內生真菌 A14的揮發油進行了成分分析,并通過歸一化法確定了各成分的相對百分含量。結果見表 2。

共得到 14個色譜峰,鑒定出 14個成分,占總油量的 96.34%。主要化學成分為蜂蜜曲菌素,約占揮發油峰面積的 93.41%,其余化學成分還包括有機酸類 (1.74%)、芳香族類 (0.68%),酚類(0.15%)和萜類 (0.14%)化合物。

表2 白木香內生真菌 A14揮發油成分及含量Table 2 Constituent and contents of volatile oil ofA14 fromA.sinensis

4 討論

劉玉峰等[5]曾報道白木香葉揮發油中的主要化學成分為飽和脂肪酸,如十六碳烷酸、十四碳烷酸、十五碳烷酸、壬酸等;本研究組[6]曾報道白木香種子揮發油中存在高含量的棕櫚酸和油酸等脂肪酸;之后又報道了[7]白木香花和果實的揮發油成分,除了以脂肪酸為主外,還含有壬酸、水楊酸芐酯、肉豆蔻酸等致香成分;除此之外,本研究組[8]還研究了兩株從白木香健康部分分離得到的枝頂孢霉屬內生真菌的揮發油成分,報道其均以油酸、亞油酸、棕櫚酸等脂肪酸為主,并含有 1,8-桉葉油素、姜烯、芳姜黃烯等萜類成分。本次研究發現,從白木香產香的樹脂部位分離得到的曲霉屬內生真菌 A14的揮發油中只含有少量脂肪酸,約占揮發油峰面積的1.74%,而以蜂蜜曲菌素為主要成分,約占揮發油峰面積的 93.41%,這與之前報道過的白木香花、葉、果實以及種子的揮發油成分有明顯差別[7-9],同時也與白木香健康部位內生真菌的揮發油成分明顯不同。

體外抗菌活性測試結果表明,白木香內生真菌A14的揮發油成分對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以及白色念珠菌均表現出抑制作用。

本次研究從白木香曲霉屬內生真菌 A14的揮發油中發現了大量的蜂蜜曲菌素,約占揮發油峰面積的 93.41%。據報道,蜂蜜曲菌素也稱為赭曲菌素 (8-羥基-3-甲基-3,4-二氫異香豆素),結構如圖,最初分離自蜂蜜曲霉真菌Aspergillusmelleus和赭曲霉真菌A.ochracenus。1996年,Canedo等的動物試驗研究表明:蜂蜜曲菌素具有抗癌活性。另有文獻報道[9],蜂蜜曲菌素具有良好的抗真菌、殺蟲活性,這與我們進行的內生真菌 A14揮發油抗菌試驗結果相符。我們由此推測,蜂蜜曲菌素為內生真菌A14的抗菌有效活性成分,曲霉屬內生真菌 A14有望開發為藥用真菌,有待深入研究。同時而白木香中尚有豐富的內生真菌資源,值得進行進一步探討。

圖1 蜂密曲菌素Fig.1 Mellein

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Volatile Constituents and Their Anti microbial Activities of Endophytic FungusAspergillussp.A14 fromAquilaria sinensis

PENG Ke1,2,MEIWen-li1,2,WU Jiao1,2,DA IHao-fu1,2＊

1Hainan Key laboratory for research and development of natural products from Li folk medicine,Institute of Tropical B ioscience and B iotechnology,Chinese Acade my of Tropical Agricultural Sciences;2Haikou Key laboratory for research and development of tropical natural products,571101,Haikou,Hainan,PR China

Q939.5;R284.1

A

1001-6880(2011)01-0085-04

2009-08-101 接受日期:2009-11-25

海南省中藥現代化重大專項項目 (2010ZY005);海南省重點科技計劃項目(2010183);海口市重點科技計劃項目(2010-027)

＊通訊作者 Tel:86-898-66988061;E-mail:hfdai2001@yahoo.com.cn