N-酰化低聚殼聚糖衍生物還原能力的研究

孫 濤,銀旭紅,康永峰,邵則淮,翁文榮

上海海洋大學食品學院,上海 201306

N-?；途蹥ぞ厶茄苌镞€原能力的研究

孫 濤＊,銀旭紅,康永峰,邵則淮,翁文榮

上海海洋大學食品學院,上海 201306

對低聚殼聚糖進行N-酰化改性,制得取代度相同的N-馬來酰低聚殼聚糖 (NMCOS),N-琥珀酰低聚殼聚糖 (NSCOS),N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖 (NPCOS),其中 NMCOS1、NSCOS1、NPCOS1的取代度均為 0.25;NMCOS2、NSCOS2、NPCOS2的取代度均為 0.49。考察了 6種N-酰化低聚殼聚糖衍生物的還原能力。結果表明:當取代度相同時,N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖的還原能力最強,其次是N-馬來酰低聚殼聚糖,N-琥珀酰低聚殼聚糖的還原能力最差。這可能是由取代基的性質不同所致。

低聚殼聚糖;N-?；?取代度;還原能力

Abstract:N-maleoyl chitosan oligosaccharide(NMCOS),N-succinyl chitosan oligosaccharide(NSCOS)andN-phthaloyl chitosan oligosaccharide(NPCOS)with the same substituting degree were prepared byN-acylation of chitosan oligosaccharide.The substituting degrees of NMCOS1,NSCOS1 and NPCOS1 were 0.25.The substituting degrees of NMCOS2,NSCOS2,and NPCOS2 were 0.49.Their power reducing were evaluated and the results showed the order of the power reducing of theN-acyl chitosan oligosaccharide with the same substituting degrees isNPCOS＞NMCOS＞NSCOS.Thatmay be related to the properties of the substituting groups.

Key words:chitosan oligosaccharide;N-acyl;substituting degree;power reducing

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

低聚殼聚糖 (浙江金殼生物化學有限公司,凝膠色譜測定其分子量為 5000 Da,脫乙酰度為95%);其余試劑均為分析純,購自上海化學試劑公司;抗氧化測試所需溶液由二次蒸餾水配制。磁力攪拌器,pH計,分光光度計,電導率儀,EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀,Waters 515型凝膠色譜儀。

1.2 N-?；途蹥ぞ厶堑闹苽?/h3>

1.2.1 N-馬來 (鄰苯二甲)酰低聚殼聚糖的制備

稱取兩份 5.0 g低聚殼聚糖分別加入 100.0 mL蒸餾水溶解,攪拌溶解,分別稱取 1.0和 1.5 g的馬來酸酐 (0.5 g和 2.5 g鄰苯二甲酸酐),用 20.0 mL丙酮溶解,然后緩慢加入反應器,在室溫下攪拌反應15 h,然后用丙酮沉淀,過濾,產物用丙酮反復洗滌,最后在 60℃烘干,得到 NMCOS1和 NMCOS2(NPCOS1和 NPCOS2)[5]。

低聚殼聚糖是甲殼素 /殼聚糖的降解產物,它能溶于水。低聚殼聚糖分子結構上有大量的氨基和羥基,具有優良的抗氧化活性[1,2]。同時它也可以進行多種化學改性。酰化改性是低聚殼聚糖的一種重要改性方式,既可以在羥基位上反應 (O-?；?生成酯,也可以在氨基上反應 (N-?；?生成酰胺。由于氨基的反應活性比羥基強,?；磻装l生N-?；磻猍3]。N-取代基結構和取代度對N-酰基低聚殼聚糖的性能有重要的的影響,但是有關他們之間關系的研究,尚未見很多報道。

還原能力是評定抗氧劑活性的重要指標[4]。本文制備了取代度相同的N-琥珀酰,N-馬來酰和N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖,研究了取代基團對還原能力的影響。本研究為低聚殼聚糖化學改性的進一步研究提理論基礎。

1.2.2 N-琥珀酰低聚殼聚糖制備

參照文獻并稍做改進,稱取兩份 5.0 g低聚殼聚糖分別溶于 100 mL水中,然后轉移到一個細頸瓶中,分別稱取 1.0和 2.5 g琥珀酸酐溶解于 50 mL丙酮中,在室溫下,30 min中內緩慢加到細頸瓶中,然后在 40℃溫度下反應 4 h,反應完畢后,冷卻至室溫,用過量的丙酮沉淀,過濾,產物用丙酮反復洗滌,最后產物在 40℃真空干燥 24 h,得到白色的N-琥珀酰低聚殼聚糖 NSCOS1和 NSCOS2[6]。

1.3 結構表征

1.3.1 紅外光譜

紅外光譜在 EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進行,采用 KBr壓片法制樣,測定波數范圍為500～4000 cm-1,分辨率為 0.8 cm-1。

1.3.2 分子量的測定

凝膠色譜法測定N-酰化低聚殼聚糖衍生物的平均分子量大小。測試條件如下:柱子:TOSOH B IOSEP TSK-Gel G4000S WXL(7.8×300 mm,Made in Japan);流動相:0.2 M醋酸鈉和醋酸緩沖溶液,pH=4.8;色譜儀:Waters 515型凝膠色譜儀,檢測器:Waters 2410示差折光檢測器 (美國 Waters公司);進樣量:50μL;柱溫:40℃;標準品:葡聚糖,平均分子量分別是 413000(Da),188000(Da),76900(Da),43200(Da),10500(Da)。

1.3.3 取代度的測定[7]

準確稱量樣品 0.1000 g置 500 mL燒杯內,準確加入 0.1038 mol/L HCl標準溶液 20.00 mL溶解樣品,再加入去離子水 200 mL稀釋、混勻,用0.4685 mol/L NaOH標準溶液返滴,測定電導率值。做電導率-氫氧化鈉體積關系圖,添加趨勢線,求其回歸方程,按下式計算N-?；途蹥ぞ厶堑娜〈?X=C1V1-C2V2;161X+203Y+262Z=m;(X+Z)/(X+Y+Z)=DD;Z/(X+Y+Z)=DS。其中C1,C2分別為 HCl和 NaOH標準溶液的濃度 (mol/L);V1為移取 HCl的體積,V2為滴定至第一個轉折點處消耗 NaOH的體積;X為N-?；瘹ぞ厶侵忻撘阴５慈〈鷨卧?(相對分子質量 161)的數量;Y為未脫乙酰單元 (相對分子量為 203)的數量;Z為?；瘑卧?(琥珀酰化,馬來?；?鄰苯二甲?；南鄬Ψ肿淤|量分別是 262,260,310);m為樣品質量(mg),DD為殼聚糖的脫乙酰度;DS為N-酰化低聚殼聚糖的取代度。

1.4 還原能力的測定

還原能力根據文獻[8]測定并稍做改進。取 2.0 mL不同濃度的樣品,加入 pH=6.60的 0.2 mol/L磷酸緩沖液 1%鐵氰化鉀溶液各 2.5 mL,混勻,50℃水浴 20 min后迅速冷卻,加入 2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,混勻后在 3000 r/min下離心 10 min,取上清液 2.0 mL,加入 2.5 mL去離子水和 0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,靜置十分鐘后在 700 nm處測定吸光度。吸光度越高,表明還原能力越強。

2 結果與討論

2.1 結構表征

圖1 COS及其N-?；苌锏募t外光譜Fig.1 FTIR spectra of COS and itsN-acyl derivatives

圖1 是低聚殼聚糖及其N-?；苌锏募t外圖。由圖上可以看出,低聚殼聚糖及其N-酰化衍生物都在 1155,1073,1030,894 cm-1附近都有強吸收峰。這組較強峰是判定低聚殼聚糖及其衍生物存在的特征吸收峰[9]。

NMCOS中 1640 cm-1為烯烴的 VC=C振動峰;1707 cm-1附近出現為不飽和羧基因共軛作用的 C=O振動吸收峰;860 cm-1附近為雙鍵中 C-H面外振動吸收峰,在低聚殼聚糖未見此峰,這些峰證實了NMCOS中馬來酸基的存在[6]。在 NPCOS中,1640 cm-1為烯烴的 VC=C振動峰;在 750 cm-1附近的吸收峰為鄰二取代苯的δAr-H面外彎曲振動峰這些峰證明了鄰苯二甲酸基的存在[10]。在 NSCOS中,1400～1200 cm-1的吸收峰是琥珀酸碳結構的振動峰,這證明了 NSCOS中琥珀酸基的存在[11,12]。NMCOS、NPCOS和 NSCOS在 1560 cm-1附近的仲酰胺的δNH振動峰在衍生物中明顯增大,同時在 1320 cm-1附近出現 VC-N伸縮振動峰,并且在 1073和1023 cm-1處的 C3仲羥基和 C6伯羥基的 C-O的伸縮振動吸收峰與殼聚糖相比沒有明顯變化,這均證明反應發生在氨基上[13]。

凝膠色譜法測得 NPCOS1、NMCOS1和 NSCOS1

的分子量分別為 5829、5733和 5772,NPCOS2、NMCOS2、NSCOS2的分子量分別為 6939、6310和6437。電導滴定法測定取代度 NPCOS1、NMCOS1、NSCOS1的取代度均為 0.25,NPCOS2、NMCOS2、NSCOS2的取代度均為 0.49。

2.2 還原能力

還原能力與抗氧化能力之間有著密切的關系[14]。圖 2是取代度為 0.25的 NPCOS1、NMCSO1和 NSCOS1的還原能力曲線圖。由圖可知,隨著樣品濃度的升高,還原能力逐漸增強。當濃度為 0.4 mmol/L時 ,NPCOS1、NMCOS1和 NSCOS1的吸光值分別是 0.52、0.48和 0.43。NPCOS1、NMCSO1和NSCOS1的還原能力大小順序依次為 NPCOS1＞NMCOS1＞NSCOS1。圖 3是取代度為 0.49的NPCOS2、NMCOS2和 NSCOS2還原能力曲線圖。當濃度為 0.4 mmol/L時,NPCOS2、NMCOS2和 NSCOS2的吸光值分別是 0.57、0.49和 0.44,與取代度為 0.25時一樣,NPCOS2、NMCOS2和 NSCOS2的還原能力大小為 NPCOS2＞NMCOS2＞NSCOS2。隨著取代度的升高,NPCOS的還原能力始終最強,其次是 NMCOS,NSCOS的還原能力最差。

抗氧化物質通過提供電子阻斷 Fe2+向 Fe3+轉變,表現出一定的還原能力。低聚殼聚糖主要是由單元分子結構上的氨基和羥基提供電子阻斷 Fe2+向 Fe3+轉變。當低聚殼聚糖發生N-?；?其部分氨基被取代基取代。取代度相同,羥基和殘余氨基數目相同。他們還原能力的差異可能是由取代基不同所致。

NPCOS、NMCOS和 NSCOS是在殼聚糖上的氨基位上分別引進-COC6H4COO–、-COCH=CHCOO–和-COCH2CH2COO–,這三種取代基團都是吸電子基團,它們能降低聚殼聚糖分子結構的電子云密度,使分子內、分子間生成氫鍵的幾率降低,從而增強氨基和羥基的活性,供氫能力增強,有利于還原能力。三種取代基的吸電子能力大小順序依次為:-COC6H4COO–＞-COCH = CHCOO–＞ -COCH2CH2COO–,故他們的還原能力大小為NPCOS ＞NMCOS ＞NSCOS。

3 結論

本文通過合成相同取代度的N-馬來酰低聚殼聚糖、N-琥珀酰低聚殼聚糖和N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖,并通過考察其還原能力,研究了取代基團對低聚殼聚糖還原能力的影響。結果表明,取代度相同時,N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖的還原能力始終最強,其次是N-馬來酰低聚殼聚糖,再次是N-琥珀酰低聚殼聚糖,這是由于取代基的性質不同所致,吸電子效應鄰苯酰基 ＞馬來酰基 ＞琥珀?；?。本實驗對低聚殼聚糖的選擇性功能化提供了新的思路。

1 Liu HT,LiWM,Xu G,et al.Chitosan oligosaccharides attenuate hydrogen peroxide-induced stress injury in human umbilical vein endothelial cells.Pharm Res,2009,59:167-175.

2 RaoMS,Chander R,Sharma A.Synergistic effect of chitooligosaccharides and lysozyme for meat preservation.Food Sci Technol,2008,41:1995-2001.

3 Zhang C,PingQN,Zhang HJ,et al.Synthesis and characterization of water-solubleO-succinyl-chitosan.Eur Polym J,2003,39:1629-1634.

4 Meir S,Meir J,Kanner B,et al.Dete rmination and involvement of aqueous reducing compounds in oxidative defence systems of various senescing leaves.J Agric Food Chem,1995,43:1813-1815.

5 Wang ZY(王周玉),Jiang ZJ(蔣珍菊),Li FS(李富生),et al.Synthesis and characterization ofwater-solubleN-acyl chitosan.J Sichuan Univ Sci Tech(四川工業學院學報),2004,23:73-75.

6 Zhu AP,Chen T,Yuan LH.Synthesis and characterization ofN-succinyl-chitosan and its self-assembly of nanospheres.Carbohydr polym,2006,66:274-279.

7 Huo XY(霍秀穎),ZhangXH(張小華),WuQ(吳清).Determination of substitution degree ofN-succinyl-chitosan by conductometric titration.J Beijing Univ Tradit Chin Med(北京醫藥大學學報),2007,30:700-702.

8 Yen GC,Chen HY.Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their ant imutagenicity.J Agric Food Chem,1995,43:27-32.

9 WangAQ(王愛勤).Chitin Chemistry(甲克素化學).Beijing:Science Press,2007:60-62.

10 Yi Y(易喻 ),Yang H(楊好 ),Ying GQ(應國清 ),et al.Synthesis and properties ofN-phthaloyl-chitosan.Chem IndusEng Pro(化工進展),2006,5:542-545.

11 SuiWP,Wang YH,Dong SL,et al.Preparation and properties of an amphiphilic derivative of succinyl-chitosan.Colloids and Surfaces A:Physicochem Eng Aspects,2008,316:171-175.

12 WangQ(汪 琴 ),Wang AQ(王 愛 勤 ).Study on synthesis and propertiesofN-succinyl-chitosan.Mod Food Sci Tech(功能高分子學報),2004,17:51-54.

13 Hirano S,Ohe Y,Ono H.SelectiveN-acylation of chitosan.Carbohydr Res,1976,47:315-320.

14 Duh PD,Du PC,Yen GC.Action of methanolic extract of mung bean bulls as inhibitors of lipid peroxidation and noN-lipid oxidative damage.Food Chem Toxic,1999,37:1055-1061.

Power Reducing ofN-acyl Chitosan O ligosaccharide

SUN Tao＊,Y IN Xu-hong,KANG Yong-feng,SHAO Ze-huai,WENGWen-rong
College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306

Q58;R284.3;TS202.3

A

1001-6880(2011)01-0098-04

2009-06-15 接受日期:2009-09-02

上海市教育委員會科研項目 (07ZZ134);上海市教委重點學科建設項目專項基金(J50704)

＊通訊作者 Tel:86-21-61900363;E-mail:taosun@shou.edu.cn