高速逆流色譜法分離制備花生殼中的黃酮類化合物

牛丹丹,劉彩霞,劉繡華,李明靜＊1河南大學化學化工學院;

河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室,開封 475004

高速逆流色譜法分離制備花生殼中的黃酮類化合物

牛丹丹1,2,劉彩霞1,2,劉繡華2,李明靜1,2＊1河南大學化學化工學院;2

河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室,開封 475004

應用高速逆流色譜法首次從花生殼中分離制備了 3種黃酮類化合物。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸 (5∶3∶3.5∶5∶0.25,v/v)為兩相溶劑系統,在主機轉速 800 r/min、流速 2 mL/min、檢測波長 275 nm條件下進行分離制備,純度用 HPLC法測定,各化合物結構經質譜和核磁共振氫譜、碳譜鑒定。結果表明,100 min內從70 mg花生殼粗提物中一步分離制備得到木犀草素 11.0 mg,香葉木素 2.2 mg,5,7-二羥基色原酮 5.2 mg,其純度均達 96.0%以上。利用該方法可以對花生殼中的黃酮類化合物進行快速的分離和純化。

高速逆流色譜;花生殼;木犀草素;香葉木素;5,7-二羥基色原酮

Abstract:Three flavoneswere prepared,isolated and purified from peanut hull by high-speed counter-current chromatography(HSCCC)for the first time.A two-phase solvent system composed of n-hexane:ethyl acetate:methanol:water:acetic acid(5∶3 ∶3.5∶5∶0.25,v/v)was used.The obtained fractionswere analyzed by HPLC and identified byMS,1H and13C NMR.W ithin 100 minute,11.0 mg of luteolin,2.2 mg of dios metin,and 5.2 mg of 5,7-dihydroxychromonewith their purities over 96.0%were obtained from 70 mg crude extractof peanut hull in one-step elution under the conditions of a flow rate of 2.0 mL/min,while the apparatus rotated at 800 r/min and the effluentwas detected at 275 nm.The results indicated thatHSCCC was a powerful technique for the separation and purification of flavones from the peanut hull.

Key words:HSCCC;peanut hull;Luteolin;Dios metin;5,7-dihydroxychromone

花生 (A rachis hypogaeaL.)亦名落花生,長生果,屬豆科一年生草本科植物。我國廣泛種植花生,在花生的加工過程中,每年產生花生殼約 450萬噸,其中大部分被當作廢棄物,僅有少量被加工成飼料或用于化工原料,資源利用率較低[1]。花生殼中以木犀草素為代表的黃酮類化合物具有降低血膽固醇、降血壓、降血脂和擴張冠狀動脈等作用,還具有抗氧化、鎮咳、祛痰、平喘、抗菌、消炎、增強免疫和抗腫瘤等藥理活性[2-4]。因此,分離制備花生殼總黃酮中的活性成分對進一步研究黃酮類化合物藥效作用機制和開發新的天然藥物具有重要的意義。

目前,花生殼的提取分離主要采用柱色譜法,分離周期長,消耗溶劑多,操作復雜。高速逆流色譜(High-speed countercurrent chromatography,HSCCC)作為一種新型分離純化技術,操作方便、快捷,分離度較高,液-液分配體系選擇廣泛,克服了由固相載體帶來的樣品結合、失活、污染等缺點。它已被廣泛應用于天然產物活性成分的分離制備和中草藥的分析鑒定[5,6]。本文采用乙醇提取和 LSA-30型大孔吸附樹脂從花生殼中得到粗提物,以此粗提物經HSCCC一步分離得到木犀草素、香葉木素、5,7-二羥基色原酮 (純度均高于 96.0%),為花生殼進一步開發利用提供了一種快速實用的新方法。目前,尚未見 HSCCC分離制備花生殼中的黃酮類化合物。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TBE-300A型高速逆流色譜儀 (中國上海同田生化技術有限公司);AKTA purifier泵及紫外檢測系統 (美國 GE公司);Agilent 1100 HPLC儀 (美國Agilent公司);超聲波清洗器 (上海現科儀器有限公司);核磁共振儀 (Bruker AV400);質譜儀 (Bruker ESQU IRE-LC);XTS顯微熔點儀 (溫度計未校正)。

1.2 試劑

正己烷、乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸均為分析純,高效液相色譜所用的甲醇為色譜純,均為天津市四友精細化學品有限公司;水為二次蒸餾水;LSA-30型大孔吸附樹脂 (西安藍曉科技有限公司)。

1.3 材料

花生殼采自河南開封近郊,40℃烘干,粉碎,備用。

2 實驗方法

2.1 花生殼總黃酮粗提物的制備

取花生殼粉末 300 g,置于 10 L圓底燒瓶中,加入 70%乙醇 7 L,80℃水浴回流提取 3次,每次 2.5 h,抽濾,合并濾液減壓濃縮至無醇味。將濃縮液經LSA-30型大孔吸附樹脂吸附后,先用蒸餾水淋洗至無色,除去水溶性雜質,依次用 30%、50%、70%、95%的乙醇洗脫至三氯化鋁顯色劑無顏色變化,收集洗脫液經減壓濃縮、冷凍干燥,得花生殼粗提物 4 g,備用。

2.2 溶劑體系及樣品溶液的配制

在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸 (5∶3∶3.5∶5∶0.25,v/v)兩相溶劑體系 ,充分震搖后在室溫下靜置 12 h。使用前將上相和下相分離,超聲脫氣 30 min,冷卻、待用。稱取 70 mg花生殼粗提物,用溶劑體系的上下相各 4 mL超聲溶解樣品,備用。

2.3 高速逆流色譜法分離制備

開啟恒溫循環器,設定溫度為 25℃,以 10 mL/min的流速將上相 (固定相)泵入主機管路,當有固定相流出時,改用 2 mL/min的流速泵下相 (流動相),同時開啟 AKTA purifier檢測系統,按 800 r/min的轉速啟動主機。觀察透明容器,待流動相以液滴形式穿透固定相,從管柱出口流出,且基線穩定后,將樣品溶液由載樣注射器經進樣圈注入。管柱出口處的流出物經 AKTA purifier的紫外檢測器在275 nm波長下進行檢測,記錄色譜圖,根據色譜圖收集目標成分。

2.4 高效液相色譜分析條件

色譜柱:Agilent Zorbac C18(21 mm×150 mm,5 μm),流動相為 0.1%磷酸水溶液和甲醇,梯度洗脫程序為 20 min內甲醇從 35%升至 65%;檢測波長為 275 nm;柱溫為 30℃;進樣量為 10μL;流速為0.3 mL/min。

3 結果與討論

3.1 溶劑系統選擇

在高速逆流色譜中,溶劑體系的選擇至關重要,合適的溶劑體系是其分離的關鍵。通常樣品成分在溶劑系統中的分配系數及管柱中固定相能否實現較高的保留值均會影響分離效果。根據色譜理論,利用 HSCCC進行樣品分離的必要條件是樣品在互不相溶的兩相中具有合適的分配系數[7],一般情況下分配系數在 0.5～2之間,固定相保留值在 50%以上,及兩相溶劑體系分層時間小于 30 s,能得到滿意的分離效果。分配系數的測定,可利用 TLC、HPLC、HPCE來測定[8,9],本文采用 TLC和 HPLC測定。

3.1.1 薄層色譜法 (TLC)

實驗選取乙酸乙酯 -甲醇 -水 、氯仿 -甲醇 -水 、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水三個體系做為分離的溶劑系統。分別配制不同比例的上述三個體系,取上下相各 5 mL于 10 mL具塞量瓶中,加入 5 mg花生殼粗提物,超聲溶解,轉移至分液漏斗中,靜置分層,用毛細管取近似等量的上下相于硅膠薄層板上,以氯仿-乙酸乙酯-冰醋酸 (1∶1∶0.02,v/v)為展開劑,展開,碘顯色。薄層色譜的分析結果表明:溶劑體系為乙酸乙酯 -甲醇 -水 (2∶1∶1,v/v)時 ,目標化合物基本集中在下相甲醇和水的體系中,不符合溶劑體系選擇的一般要求;溶劑體系為氯仿-甲醇-水 (3∶4∶2,v/v),正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 (5∶3∶3.5∶5,v/v)時 ,目標化合物在溶劑體系的上下相中溶解程度相近。通過薄層色譜對溶劑體系的初步篩選確定氯仿-甲醇 -水 (3∶4∶2,v/v),正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 (5∶3∶3.5∶5,v/v)為分離體系。

3.1.2 高效液相色譜法 (HPLC)

用 HPLC測定 3.1.1條件下確定的兩個體系的分配系數:稱取適量的花生殼粗提物置于 5 mL試管中 ,分別加入氯仿 -甲醇 -水 (3∶4∶2,v/v),正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 (5∶3∶3.5∶5,v/v)兩體系的上下相各 1 mL,超聲使樣品充分溶解,靜置平衡,取上下相各 0.2 mL,離心濃縮干,用色譜級甲醇溶解,經HPLC檢測,并計算出各目標化合物的分配系數 (K=Aupper/Alower,A為目標峰面積),結果見表 1。

表1 3種黃酮類化合物在兩種溶劑體系中的分配系數(K)Table 1 The K(Partition coefficients)valuesof 3 flavones(1-3)in tow solvent systems

由表 1可知,樣品在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶3∶3.5∶5,v/v)溶劑體系中的分配系數在 0.5～2范圍內,通過 HSCCC預分離后,3種化合物可以分離,但分離時間過長。通過實驗發現,在正己烷-乙酸乙酯 -甲醇 -水 (5∶3∶3.5∶5,v/v)體系中加入一定比例的冰醋酸,可以改善分離效果。當實驗改為正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋酸 (5∶3∶3.5∶5∶0.25,v/v)體系分離時,3種化合物分離較好,固定相保留率為 65%,分離時間適中。實驗表明,由于所分離黃酮類化合物分子結構中含有酚羥基,在體系中加入少量的酸,讓目標樣品不電離增加有機性,從而可以改善分離效果[10,11]。因此,確定正己烷-乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋酸 (5∶3∶3.5∶5∶0.25,v/v)為最終使用體系。

3.2 HSCCC分離參數的考察

3.2.1 樣品溶劑量的考察

實驗采用等體積的上下相進行樣品的溶解,分別考察了總體積為 (5、6、7、8、9、10 mL)溶劑量溶解70 mg花生殼粗提物。實驗結果表明:當溶劑量小于 8 mL時有部分被分離物質不溶;當溶劑量大于 8 mL時,雖然被分離物質能夠很好的被溶解,但是在進行 HSCCC分離過程中會有固定相的流失,故采用總體積為 8 mL的溶劑量作為最佳溶劑量。

3.2.2 進樣量的考察

本實驗同時還考察了不同的上樣量 (50、60、70、80 mg),當上樣量大于 70 mg時,選用 3.2.1條件下確定溶劑用量時,不能使被分離物質徹底溶解。因此,體系進樣量不超過 70 mg為宜。

3.3 HSCCC分離制備的結果

按“2.3”節操作方法 100 min內經 HSCCC分離制備得到 3個化合物 (見圖 1中 1、2、3)。結果顯示,從 70 mg花生殼粗提物中一次分離得到化合物1(11.0 mg),化合物 2(2.2 mg),化合物 3(5.2 mg)。而且,此法分離時間短,可以采用連續進樣方式來制備此三種化合物。

圖1 花生殼粗提物高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC chromatogram of crude extract from peanut hull

圖2 (a)花生殼粗提物、(b)木犀草素、(c)香葉木素和 (d)5,7-二羥基色原酮的 HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of(a)the crude extract of peanut hull,(b)luteolin,(c)dios metin,and(d)5,7-dihydroxychromone

3.4 純度分析

采用“2.4”節的條件對高速逆流色譜所得到的化合物 1、2、3進行 HPLC檢測分析,經峰面積歸一化法計算可知純度均大于 96.0%,如圖 2所示。

3.5 結構鑒定

化合物 (1) 為黃色粉末,mp.327～329℃,EI-MSm/z:286[M]+,分子式為 C15H10O6。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.41(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6′),7.39(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.87(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.66(1H,s,H-3),6.43(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),12.97(1H,s,OH-5),10.75(1H,s,OH-7),9.91(1H,s,OH-3′),9.41(1H,s,OH-4′);13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:164.3(C-2),103.3(C-3),182.1(C-4),157.5(C-5),99.3(C-6),164.4(C-7),94.3(C-8),161.9(C-9),104.2(C-10),122.0(C-1′),113.8(C-2′),146.2(C-3′),150.2(C-4′),116.5(C-5′),119.4(C-6′)。以上光譜數據與文獻[12]報道的木犀草素一致,故鑒定該化合物為木犀草素。

化合物 (2) 為黃色粉末,mp.256～258℃,EI-MSm/z:300[M]+,分子式為 C16H12O6。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.55(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.65(1H,dd,J=8.2,2.1 Hz,H-6′),6.92(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.90(1H,s,H-3),6.50(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.20(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),13.0(1H,s,OH-5),10.8(1H,s,OH-7),9.50(1H,s,OH-3′);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:163.9(C-2),104.0(C-3),181.9(C-4),157.8(C-5),99.5(C-6),164.6(C-7),94.63(C-8),161.9(C-9),103.6(C-10),119.8(C-1′),113.10(C-2′),148.52(C-3′),151.2(C-4′),116.40(C-5′),121.0(C-6′),56.0(OCH3)。以上光譜數據與文獻[13]報道的香葉木素一致,故鑒定該化合物為香葉木素。

化合物 (3) 為黃色粉末,mp.270～272℃,EI-MSm/z:178[M]+,分子式為 C9H6O4。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:12.6(1H,s,OH-5),10.88(1H,s,OH-7),8.16(1H,d,J=610 Hz,H-2),6.26(1H,d,J=610 Hz,H-3),6.18(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.34(1H,d,J=2.1 Hz,H-8).13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:157.3(C-2),110.4(C-3),181.6(C-4),162.0(C-5),99.1(C-6),165.5(C-7),94.0(C-8),157.8(C-9),104.7(C-10)。以上光譜數據與文獻[14]報道 5,7-二羥基色原酮一致,故鑒定該化合物為 5,7-二羥基色原酮。

4 結論

本文應用高速逆流色譜法首次從花生殼粗提物中一步分離制備了木犀草素、香葉木素、5,7-二羥基色原酮三種黃酮類化合物,均達到較好的分離和純化效果。實驗結果表明,HSCCC可以從粗提物中一次分離得到多個純度較高的單體,并且可以連續進樣,分離周期短、操作快捷、簡便,對于分離得到的樣品可應用于制備對照品,研究中藥材化學成分以及新藥開發等領域。高速逆流色譜在天然產物分離純化領域具有獨特的優勢,必將促進現代分離技術應用的發展。

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Preparative Separation of Flavones from Peanut Hull by High-Speed Counter-Current Chromatography

N IU Dan-dan1,2,L IU Cai-xia1,2,L IU Xiu-hua2,L IMing-jing1,2＊1College of Che mistry and Chemical Engineering,Henan University,Kaifeng 475004,China;2

Key Laboratory of NaturalMedicine and Immunology Engineering Henan Province,Kaifeng 475004,China

R284.2;Q946.91

A

1001-6880(2011)01-0110-05

2009-10-20 接受日期:2009-12-29

河南省教育廳自然科學研究項目 (200510475040)

＊通訊作者 Tel:86-378-5918398;E-mail:lmjhellen6@163.com