甘薯提取物體外促進 PC12和 SK-N-SH細胞增殖及突起生長作用研究

孫麗華,鄭曉亮,顏冬梅,屠凌嵐,李昉赟,王 茵

浙江省醫學科學院,杭州 310013

甘薯提取物體外促進 PC12和 SK-N-SH細胞增殖及突起生長作用研究

孫麗華,鄭曉亮,顏冬梅,屠凌嵐,李昉赟,王 茵＊

浙江省醫學科學院,杭州 310013

觀察甘薯提取物促進體外培養的 PC12和 SK-N-SH細胞的增值和突起生長作用。采用體外培養 PC12和 SK-N-SH細胞,以MTT法檢測 PC12和 SK-N-SH細胞的活性率,以細胞突起長度超過 2倍胞體或突起數目 3個以上者為陽性細胞計算陽性細胞率來評價甘薯提取物對體外培養 PC12和 SK-N-SH細胞的增值和突起生長的促進作用。實驗發現甘薯提取物能夠促進 PC12和 SK-N-SH細胞的突起數目增加,長度增長,陽性細胞數增多,具有一定的神經營養作用,是一種很好的神經保護劑。

甘薯提取物;PC12細胞;SK-N-SH細胞;增殖;突起生長

Abstract:An investigation wasmade on observe the effectof s weetpotato extracton promoting PC12 and SK-N-SH cells proliferation and neurite outgrowth.Using PC12 and SK-N-SH cells cultured in vitro,as detecting the living ratesof PC12 and SK-N-SH cells byMTT and calculating positive cell rate ofwhich length of neurite exceeding 2 times of the neural body or the number of neurite exceeding 3,to evaluate the promoting effect of sweet potato on PC12 and SK-N-SH cells proliferation and neurite outgrowth.The results showed that sweet potato extract is able to promote PC12 and SK-N-SH cells neurite outgrowth and to increase the numberofpositive cells,has a certain neurotrophic effect and it is a good neuroprotective agent.

Key words:s weet potato extract;PC12 cells;SK-N-SH cells;proliferation;neurite outgrowth

隨著社會發展,神經系統退行性疾病的發病率急劇上升,對神經系統作用的食品及藥物研究已成為一項熱點,因此尋找具有神經營養活性的物質,是一件有意義的工作。神經元損傷和凋亡是老年癡呆、帕金森和腦血管病等神經系統疾病的共同病理機制。臨床上除了采用對癥治療外,神經營養和神經保護劑的應用對疾病的控制和癥狀改善也起到了良好的作用。本研究探討了甘薯提取物對體外培養神經細胞的神經營養作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

胎牛血清,購自杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM培養基和胰蛋白酶 (Trypsin),購自Gibco公司;噻唑藍 (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)和二甲基亞砜(DMSO),均購自 Sigma公司;異丙醇,購自匯普化工儀器有限公司;Recombinant Humanβ-NGF,購自PeproTech公司。

1.1.2 儀器設備

Shellab Model 2300型 CO2培養箱 (Sheldon Manufacturing公司產品);DG3022A型酶聯免疫檢測儀 (華東電子管廠生產);BH-2生物顯微鏡 (日本Olympus公司產品);MOTI C生物顯微圖像采集分析系統 (廈門麥克奧迪實業集團有限公司產品)。

1.1.3 甘薯提取物

于 4℃避光保存備用,給藥前以DMSO溶解,再以無血清DMEM稀釋至所需濃度 (DMSO終濃度不高于 0.1%)。

1.1.4 細胞株

人神經母細胞瘤 (SK-N-SH)細胞和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤 (PC12)細胞,購自中科院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 甘薯提取物的制備

取西蒙甘薯凍干粉加無水乙醇,于恒溫水浴震蕩器中震蕩提取,經真空抽濾或離心,上清液于旋轉蒸發真空濃縮,完全除去乙醇后用氫氧化鈉的甲醇溶液溶解后,水解,水解液用氯仿充分混合振蕩提取,取下層溶液真空濃縮蒸干完全除去溶劑,后經硅膠柱層析得甘薯提取物。

1.2.2 細胞株培養

用含 10%胎牛血清、40 U/ml慶大霉素的DMEM培養液,于 37℃、5%CO2和飽和濕度的培養箱中傳代培養,取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.3 體外細胞活率檢測試驗 (MTT法)

取對數生長期 SK-N-SH細胞和 PC12細胞分別調整細胞懸液濃度為 5×104個 /mL和 2×104個 /mL,每孔 100μL細胞懸液接種于 96孔細胞培養板中,接種 24 h后給予不同濃度受試物 (100μL/孔),分別設空白對照組以及 5個濃度 (0.08,0.4,2,10,50μg/mL)受試物組。SK-N-SH細胞和 PC12細胞分別繼續培養 144 h(6 d)和 96 h(4 d)后,每孔加入 100μL MTT(1 mg/mL,以 DMEM培養液溶解),37℃孵育 4 h,棄去各孔內液體后加入 150μL酸化異丙醇 (含 0.04 mol/L HCl),避光放置 30 min,DG3022A型酶聯免疫檢測儀測定 570 nm處吸光度,計算細胞活率。

1.2.4 體外細胞突起生長檢測[1]

取對數生長期 SK-N-SH細胞和 PC12細胞分別調整細胞懸液濃度為 5×104個 /mL和 2×104個 /mL,每孔 3 mL細胞懸液接種于 96孔細胞培養板中,接種 24 h后給予三個濃度 (0.1,1,10μg/mL)受試物,光學顯微鏡下觀察給藥后 24,48,72,96 h細胞突起生長情況,每組隨機選取 10個視野拍照,以突起長度超過胞體 2倍或突起數量 3個以上者為陽性細胞,計數陽性細胞率,以受試物處理組細胞陽性率與對照組細胞陽性率的比值評價受試物促進細胞突起生長活性。

1.2.5 數據統計方法

實驗進行三次重復,結果以±s表示。用SPSS13.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 甘薯提取物對神經細胞活率的影響

圖1、圖 2是 MTT法顯示的 PC12細胞和 SK-NSH細胞的增殖生長情況,結果表明 PC12細胞在不同濃度作用情況下其細胞活力都明顯高于空白對照組,細胞生長明顯增快,倍增時間明顯縮短,細胞密度不斷增加,在中等濃度 2μg/mL時細胞活力最強,其細胞活率提高 34.7%和 24.7%。而 SK-NSH細胞在高濃度 50μg/mL時表現出了生長萎縮的現象,這可能是高濃度時細胞生長過快,其所需的營養耗竭,導致細胞生長活力減小。而在其他濃度作用時與空白對照組相比仍表現出了細胞生長活力的明顯增強,并隨受試物濃度的增加而增強,呈現出了劑量依賴性生長。

2.2 甘薯提取物對神經細胞突起生長的影響

甘薯提取物對神經細胞突起生長的影響情況如圖 3、圖 4所示,實驗證實受試物樣品給予 24 h后觀察,無論在低劑量、中劑量還是高劑量濃度情況下PC12細胞和 SK-N-SH細胞其陽性細胞率的比值均明顯高于空白對照組,PC12細胞的陽性率最高可達到空白對照組的 6.2倍左右,SK-N-SH細胞的陽性率最高可達到空白對照組的 1.7倍左右,說明受試物樣品能夠明顯促進 PC12細胞和 SK-N-SH細胞神經突起的分化和伸長生長,具有一定的神經營養作用。

在顯微鏡下對細胞形態觀察的實驗結果如圖 5～8所示,未經處理的 PC12細胞呈圓形、短梭形或三角形,有的細胞兩極有短突起。添加不同濃度的甘薯提取物組的 PC12細胞在培養 48 h后即有明顯突起伸出,有的較長且增粗,長短不一突起個數也明顯增多。而未處理的 SK-N-SH細胞呈梭形或多角形有的有較短突起,而受試物樣品組 SK-N-SH細胞在 72h明顯分化出了神經突起并有了明顯的伸長生長。這說明受試物在 0.1μg/mL濃度下,對 PC12細胞及 SK-N-SH細胞的生長及突起伸長就有一定的促分化作用,進一步說明受試物具有一定的神經營養活性。

3 討論

離體培養神經細胞是研究神經元損傷和藥物作用的體外理想模型 。體外培養的大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)和人類神經母瘤細胞 (SK-N-SH細胞)雖然不是真正的神經元,但其在體外培養狀態下的生長特性類似神經元,具有較典型的神經內分泌細胞特征,故廣泛用于研究神經細胞分化、離子通道、受體、遞質分泌的實驗材料,也是研究神經毒性的最主要的細胞株[2-3]。

甘薯是旋花科甘薯屬的一個重要栽培品種,又名紅薯、白薯、地瓜、番薯、山芋、紅苕等。世界上有111個國家栽培甘薯。在現代生活中,甘薯早已超出傳統意義上糧食的概念。隨著人們對甘薯研究的深入,甘薯中的一些有效成分正在逐漸被人們所揭示[4],然而有關甘薯對神經系統的營養作用尚未見報道,是一個非常值得探索的領域。

本實驗研究結果顯示西蒙甘薯提取物能夠促進PC12細胞和 SK-N-SH細胞的增值和細胞突起生長、伸長,對神經細胞具有一定的營養作用,但其具體有效成分尚待進一步研究。本實驗為甘薯類功能食品干預神經退行性疾病的研究奠定了基礎,同時隨著老齡化社會的到來,神經系統的營養物質的需求也將不斷上升,具有廣闊的開發前景和研究意義。

1 AkiraM,Jiro F,Masaharu K,et al.ALK receptor tyrosine kinase promotes cell growth and neurite outgrowth.J Cell Sci,2004,117:3319-3329.

2 Cui X(崔旭 ),Yuan H(袁紅 ),WangQ(王青 ),et al.Efect of Yi Zhi San on cell proliferation and apoptosis in cultured PC12 cell.Chin J Geriatr Heart B rain Vessel D is(中華老年心腦血管病雜志),2006,8(3):198-201.

3 Chu YQ(楮燕琦 ),LiW(李瑋 ),Zhang L(張蘭 ),et al.Efects of protein phosphatase inhibitorOkadaic acid on phosphorylation of Tau protein in human neuroblastoma SK-N-SH cells.Chin J Cell B io(細胞生物學雜志),2006,28:742—746.

4 Zhao XL(趙秀玲).Nutrition componentsof sweetpotato and its functions.Food Nutr Chin(中國食物與營養),2008,10:58-60.

Effects of Sweet Potato Extract on Promoting PC12 and SK-NSH Cells Proliferation and Neurite Outgrowthin V itro

SUN Li-hua,ZHENG Xiao-liang,YAN Dong-mei,TU Ling-lan,L I Fang-yun,WANG Yin＊
Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013

R965.1

A

1001-6880(2011)01-0149-04

2010-04-16 接受日期:2010-07-22

浙江省科技廳重大專項項目(2007C12074)

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