蘇木醇提物對樹突狀細胞IL-12 P40mRNA轉錄的影響

黑龍江省中醫研究院（150036）張春戩 鄭佳新 馮麗輝

蘇木，豆科云實屬，藥用部位為其干燥心材。近年來，國內外一些研究表明，蘇木具有抑制T淋巴細胞轉化功能的作用。本研究通過觀察蘇木醇提物對（dendritic cell，DC）IL-12 P40mRNA轉錄的影響，在細胞分子水平闡述其調節免疫的作用機制。樹突狀細胞在體內分布廣泛，是唯一能激活初始型T細胞的抗原提成細胞，能夠調節和調控細胞免疫功能[1]。IL-12是近年來發現的一種異源二聚體分子，主要由樹突狀細胞、巨噬細胞和B淋巴細胞對細菌、細菌產物及細胞內寄生物等發生反應而產生，是啟動免疫殺傷最主要的細胞因子。

附圖 對照組與各治療組IL-12電泳圖

1 材料與方法

1.1 動物及試劑動物 近交系BALB／c小鼠（16～20g），C57BM小鼠（20～25g），購于哈爾濱市獸研所。允許動物在無特殊病原體環境中隨意進食標準的飼料和純凈水。

1.2 主要試劑 蘇木醇提物，黑龍江省中醫研究院制劑室提供；重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte.macrophage colony stimulating Factor，GM—CSF），購自美國Biosource公司；胎牛血清（Fetal calf serum，FCS）和RPMI l640培養基，購自美國Hyclone公司。

1.3 小鼠骨髓DC培養 DC細胞的分離培養及分組參照文獻[2]方法，無菌條件下提取BALB／c小鼠脛骨和股骨骨髓細胞，紅細胞裂解后配制成l×106／m1細胞懸液接種于6孔板中（1.5～2.5m1／孔），并在每孔中加入2m1含10%胎牛血清的RPMIl640培養基，最后加入GMCSF（終濃度為0.02mg／m1）和IL-4（500U／m1），培養7天。然后將GM-CSF誘導培養7天的骨髓來源DC細胞進行分組，采取不同處理：對照組不做任何處理；蘇木醇提物高劑量組（20μg／m1）、中劑量組（10μ g／m1）、低劑量組（5μg／ml）。上述各組DC繼續培養48 h后，收集懸液細胞。

1.4 電鏡分析 將DC細胞懸液用PH7、0.1mol／LPBS洗滌后，1000r／min離心5min，4%戊二醛固定，PBS洗滌，制成懸液滴片，1%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，掃描電鏡觀察，攝片。

1.5 RT-PCR測定IL-12 P40mRNA的轉錄細胞總RNA的提取采用TRIzolR試劑，cDNA合成采用隨機引物法，PCR擴增條件為 ：94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環。IL-12 P40序列及擴增片段長度5’-GGA TGC CCC TGG AGA AAT GG-3’5’AGG TGG AGG TCA GCT GGG AG-3’655bp。取IL-12 P40 得PCR產物5μl，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳（含0.5 μl/ml溴化乙錠）30min，紫外透射儀下觀察結果并攝片。

1.6 統計學分析 應用SPSSl3.0軟件對數據進行統計分析，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DC的掃描電鏡觀察 成熟DC的形態極不規則，有管狀斧狀偽足，有球莖狀、泡狀等細胞突起，長短不一，且表面光滑，構成不規則的形態，細胞表面有折疊結構。

2.2 IL-12 P40mRNA的表達結果：IL-12mRNA 與β-actin像素值比值均大于對照組（P＜0.05），見附圖。

3 討論

蘇木，功效主治閉經、痛經、產后惡露不盡、中風、癰疽瘡毒等，是臨床常用活血化瘀中草藥。近年的研究表明，蘇木除具有傳統療效外，還具有抗炎及免疫抑制作用。蘇木水提物對HL-60（人早幼粒白血病細胞株）有較強的細胞毒作用；在體外有與雷公藤相似的抑制人B淋巴細胞增殖作用及較強的抗器官排斥反應作用[3]。其醇提物對人體腫瘤細胞HCT-8、KB有明顯的抑制作用，能誘導細胞凋亡。

本研究中，將BALB／c小鼠脛骨和股骨骨髓細胞經GM-CSF誘導而來的DC細胞進行分組，用蘇木醇提物處理，RT-PCR測定IL-12 P40mRNA的轉錄情況。結果表明，經給予蘇木醇提物處理的DC能夠分泌高水平的IL-12 P40，進而促使T細胞轉化為殺傷性T細胞，提高T細胞的殺傷活性，找出蘇木醇提物對DC的藥物作用靶點之一，為進一步研究蘇木的免疫調節作用，以及從中藥中尋找具有明確免疫抑制作用和低副作用的免疫抑制劑打下了良好的基礎。