細葉黃皮果仁揮發油成分及抑菌作用

蘇秀芳，黃麗娟，馮佩珍

(廣西民族師范學院化學與生物工程系，廣西 崇左 532200)

細葉黃皮果仁揮發油成分及抑菌作用

蘇秀芳，黃麗娟，馮佩珍

(廣西民族師范學院化學與生物工程系，廣西 崇左 532200)

目的：研究細葉黃皮果仁揮發油的成分及抑菌作用。方法：以水蒸汽蒸餾法提取揮發油，用GC-MS對揮發油化學成分進行分析；采用紙片擴散法進行抑菌實驗研究。結果：揮發油的主要成分為：4 -甲氧基- 6 -(2 -丙烯基) -1,3-亞甲二氧基苯(47.07%)、1,2,3-三甲氧基-5-(2-丙烯基)苯(8.25%)、2,6 -二甲氧基-4-(2 -丙烯基-苯酚)(7.17%)、正十六烷酸(7.05%)及二十三烷(4.95%)；細葉黃皮果仁揮發油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及殺螟桿菌具有較強的抑制作用，最低抑菌劑量分別為0.35mg/片、0.09mg/片、0.17mg/片及0.17mg/片。

細葉黃皮；揮發油；化學成分；抑菌作用

蕓香科柑橘亞科黃皮屬細葉黃皮[Clausena anisumolens (Blanco.)Merr]，多年生常綠大灌木或小喬木，主產于我國廣西西南部、云南南部、廣東新會及越南北部和菲律賓[1-2]。細葉黃皮為珍稀佳果，果皮、果肉、果仁均可食用，果實可助食消暑、消積去滯、祛痰化氣、疏通腸胃[3]，廣西西南部民間常以食用果仁用于治療胃脹氣。枝葉可做草藥，祛風除濕[1]。

黃皮屬植物主要成分為生物堿類、香豆素類、甾醇類化合物、黃酮苷類和揮發性成分等。該屬植物具有保肝解毒、抑菌、促智、解痙攣、降血糖、抗腫瘤及抗HIV病毒等生物活性。Wang等[4]從細葉黃皮中提取到7個化合物，分別為anisumarin、isoscopoletin、umbelliferone、anisocoumarin H、capnolactone、aurapten 和7-[(E)-7'-hydroxy-3',7'-dimethylocta-2',5-dienyloxy]-coumar。汪云松等[5]從細葉黃皮中提取分離了5個化合物，分別為4-(3-methoxyphenyl-4-O-β-D-glucopyanoside)-2-butanone、3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic acid、3-(3-methoxyphenyl-4-hydroxy)-2-propenoic acid、3-(3-methoxyphenyl-4-hydroxy)-2-propenoic acid、3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoic methyl ester、3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid。

研究表明，該屬植物具有豐富的揮發性成分，不同種類、相同產地不同部分或不同產地相同部分的揮發性成分往往差異較大。蘇秀芳[6]報道廣西龍州細葉黃皮葉的揮發油成分的主要化合物類型為烯類、酸類及醇類，其中烯類占揮發油總質量的80.79%，主要成分為4-甲氧基6-(2-丙烯基)-1,3苯并二惡唑、(+)-4-蒈烯、大根香葉烯B、十六烷酸及1,2,3-三甲氧基5-(2-丙烯基-苯)；余燾等[7]報道廣西崇左邊境細葉黃皮葉揮發油的主要成分為萜品油烯、肉豆寇醚、3-蒈烯、β-月桂烯、(+)-4-蒈烯；羅輝等[8]報道湛江產黃皮葉的揮發油主要成分為順-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇、β-石竹烯、α-呢烯等；廖華衛等[9]報道廣州產黃皮果皮的揮發油主要成分為β-水芹烯、1R-α-蒎烯、α-水芹烯等；李瑞珍等[10]從廣州黃皮果中揮發油中鑒定出64種成分，主要成分為4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環己烯-1-醇、松油烯、3,7,7-三甲基-二環[4.1.0]己-2-烯；唐聞寧等[11]從海口產黃皮果揮發油中分離鑒定出43種成分，主要為萜品烯-4醇、檜萜、γ-松油烯、α-松油烯等；張建和等[12]報道黃皮果核揮發油主要成分為萜類化合物，γ-蒎烯占60.36%、檸檬烯占22.62%。徐漢虹等[13]報道齒葉黃皮精油具有一定的殺蟲活性，使用20mg/L的劑量進行熏蒸或0.2%劑量拌種都能有效地殺滅赤擬谷盜(Tribolium castaneum)成蟲或抑制其種群繁殖。

該屬植物的揮發油的主要成分為烯類，報道表明該屬植物揮發油具有一定的殺蟲活性，但抑菌活性鮮有報道。有關細葉黃皮果仁揮發油化學成分未見有報道，為了揭示其藥理作用，為開發利用細葉黃皮資源提供科學依據，本研究用GC-MS對揮發油化學成分進行分析，并對其藥理活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細葉黃皮成熟果實摘自廣西民族師范學院龍州校區院內，由該校化學與生物工程系黃秋嬋副教授鑒定為Clausena anisum-olens，去掉果肉及果皮，陰干后粉碎；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，大腸桿菌(Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，殺螟桿菌(Bacillus cereus)，以上菌種均由廣西大學農學院提供。

牛肉膏蛋白胨液體培養基、M-H肉湯 (自制)；石油醚、山梨酸鉀等均為分析純。

1.2 儀器與設備

HP6890/HP5973MS聯用儀 美國安捷倫公司；RE5298旋轉蒸發器 上海亞榮生化設備儀器有限公司；SHB-(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；LDZX-50KBS型立式電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；ZHJH-C1214B型垂直流超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養箱上海精宏實驗設備有限公司；SPH-211B搖床培養箱 上海世平實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發油提取

細葉黃皮果仁曬干，粉碎，稱取100g，用常規方法水蒸氣蒸餾6h。餾出液加入50mL石油醚萃取3次，合并萃取液。加入少量無水Na2SO4，靜置10h。回收溶劑，得黃色油狀物，具有濃郁香味，稱量得503mg，得油率為0.503%。

1.3.2 氣相色譜-質譜聯用條件

氣相色譜條件：石英毛細管柱HP-FFAP(30m×0.25mm，0.25μm)，程序升溫：從60℃開始，以4℃/min升到150℃，再以8℃/min升溫到250℃；載氣為He，柱流量1.0mL/min，進樣口溫度250℃，分流比50:1。

質譜條件：EI源；電離電壓70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍10～500u，進樣量1.0μL。

1.3.3 細葉黃皮果仁揮發油抑菌活性

1.3.3.1 細菌懸液的制備

將4種供試菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于33℃下培養24h，進行菌種活化。活化后的細菌作10倍系列稀釋，并活菌計數。用M-H肉湯將細菌分別配制成5×105CFU/mL的懸浮液。

1.3.3.2 抑菌圈的測定

小濾紙片(6mm)，放入干燥培養皿中，用立式電熱壓力蒸氣滅菌器，在氣壓121℃下滅菌25min。

揮發油用石油醚對半稀釋為系列濃度，山梨酸鉀用無菌水稀釋，將小濾紙片分別浸泡12h。用移液槍移取每種菌種分別放入培養皿中，把培養基倒入培養皿中，使菌懸液與培養基混合均勻，制成平板。將試藥浸泡的紙片置于平板內，于35℃左右恒溫培養，24h后觀察結果。如果濾紙片周圍無菌則說明有抑菌作用，即有抑菌圈。有明顯抑菌作用的測其抑菌圈的直徑。

2 結果與分析

2.1 細葉黃皮果仁揮發油的化學成分

按色譜條件和質譜條件對細葉黃皮果仁揮發油進行GC-MS分析，總離子流圖見圖1。通過HPMSD化學工作站檢索NIST98標準質譜圖庫，以及查對有關標準質譜文獻，鑒定了2 0種成分，結果見表1。

圖1 細葉黃皮果仁揮發油的總離子流量圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile nutlet oil from Clausena anisum-olenas

表1 細葉黃皮果仁揮發油的化學成分Table1 Chemical constituents of volatile nutlet oil from Clausena anisum-olenas

通過GC-MS分析，從揮發油中共分離出 20種成分，共鑒定了20個組分。由表1可知，細葉黃皮果仁揮發油的主要化學成分為4-甲氧基-6-(2-丙烯基)-1,3-亞甲二氧基苯(47.07%)、1,2,3-三甲氧基-5-(2-丙烯基)苯(8.25%)、2,6 -二甲氧基-4-(2-丙烯基-苯酚)(7.17%)、正十六烷酸(7.05%)及二十三烷(4.95%)。

2.2 揮發油的抑菌結果

表2 細葉黃皮果仁揮發油的抑菌圈直徑Table2 Diameters of inhibition zone of volatile nutlet oil from Clausena anisum-olena mm

由表2可知，細葉黃皮果仁揮發油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及殺螟桿菌具有較強的抑制作用，最低抑菌劑量分別為0.35mg/片、0.09mg/片、0.17mg/片及0.17mg/片，比食品常用的防腐劑山梨酸鉀抑菌作用強。

3 結 論

研究表明，細葉黃皮果仁揮發油含量較高，主要成分為含氧化合物，占揮發油總量的78.53%，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及殺螟桿菌具有較強的抑制作用。

4 討 論

該屬植物的揮發油主要化合物類型為烯類，而細葉黃皮果仁揮發油芳香類的成分比例較多，且芳香類分子中同時含有氧原子及雙鍵，這些結構特點決定了其具有抑菌活性。結果表明，細葉黃皮果仁揮發油對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌具有較強抑制作用，有關活性機理值得深入研究。

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[2] 黃峰, 何銑揚, 雷艷梅. 極具發展前景的細葉黃皮果[J]. 廣西熱帶農業, 2005(4): 30-31.

[3] 譚江文, 黃永平. 細葉黃皮是石山貧困地區農民增收致富門路: 關于龍州、崇左、扶綏等縣發展細葉黃皮的調查[J]. 廣西林業, 2004(4): 22-23.

[4] WANG Yunsong, HUANG Rong, LI Ningzhong, et al. Coumarins from Clausum-olens Merr[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74(7):100143-1-2。

[5] 汪云松, 沈月毛, 何紅平. 河口細葉黃皮化學成分研究[J]. 有機化學,2003, 23(增刊1): 144.

[6] 蘇秀芳. GC-MS法分析雞皮果葉揮發油的化學成分[J]. 安徽農業科學, 2008, 36(25): 10956-10957.

[7] 余燾, 楊姝麗, 孫建華, 等. 雞皮果葉揮發油的重復萃取及氣相色譜-質譜法分析[J]. 廣西農學報, 2009(4): 35-36.

[8] 羅輝, 蔡春, 張建和, 等. 黃皮葉揮發油化學成分研究[J]. 中藥材, 1998(8): 405-406.

[9] 廖華衛, 鄧金梅, 黃敏儀. 黃皮果皮揮發油成分研究[J]. 廣東藥學院學報, 2006(2): 139-141.

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[11] 唐聞寧, 康文藝, 穆淑珍, 等. 黃皮果揮發油成分研究[J]. 天然產物研究與開發, 2002(2): 26-28.

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Chemical Composition Analysis and Antimicrobial Activity of Volatile Oil from the Nutlets of Clausena anisum-olens

SU Xiu-fang， HUANG Li-juan，FENG Pei-zhen
( Department of Chemistry and Biological Engineering, Guangxi Normal Universty for Nationalities, Chongzuo 532200, China)

Objective: To study the chemical constituents and antimicrobial activity of volatile oil from the nutlets of Clausena anisum-olenas. Methods: The volatile oil was extracted by steam distillation and then analyzed by GC-MS. The disk diffusion method was used for antimicrobial activity analysis. Results: The major chemical compositions identified in nutlet oil from the plant were 4-methoxy-6-(2-propenyl)-1,3- benzodioxole (47.07%), 1,2,3-trimethoxy-5-(2-propenyl)- benzene (8.25%), 2,6-dimethoxy-4-(2-propenyl)-pheno (7.17%), n-hexadecanoic acid (7.05%) and tricosane (4.95%). The volatile oil had strong inhibitory effect against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus cereus with minimal inhibitory concentration (MIC) of 0.35, 0.09, 0.17 mg/disc and 0.17 mg/disc, respectively.

Clausena anisum-olens；volatile oil；chemical constituents；antimicrobial activity

TQ420.7

A

1002-6630(2011)03-0030-03

2010-05-28

廣西壯族自治區自然科學基金項目(2010GXNSFA013050)

蘇秀芳(1971—)，女，副教授，碩士，研究方向為天然產物活性成分的提取、分離、分析及藥理活性。E-mail：suxiufang_88@sina.com