HPLC法測定維生素B12片的含量

北京市海淀區藥品檢驗所（100083）張靜 劉志杰 李東輝

維生素B12片現行標準為《化學藥品地方標準上升國家標準》第十一冊，含量測定采用紫外分光光度法。維生素B12光學穩定性差，一般采用包糖衣這種劑型。糖衣對紫外吸收有影響，這就要求在避光條件下剝去糖衣。此法費時且對人員操作要求高，結果重現性差。筆者采用高效液相色譜法，排除了糖衣包衣對含量測定的影響，省去了剝去糖衣的繁瑣步驟，從而解決了重現性差的問題。

附圖 維生素B12 HPLC色譜圖

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：島津LC-20AT，島津SPD20A檢測器，LCsolution色譜工作站；電子天平：sartorius BP211D（d=0.01mg）。維生素B12對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號： 100248-200201）；乙腈（色譜純），磷酸二氫鉀（分析純）；維生素B12片3批（批號為C 090102；C 090302；C 080703）及空白輔料（由山西云鵬制藥有限公司提供）。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 參考文獻[1～3]中選用色譜柱：SymmetryC18（150mm×4.6mm，5μm）（Waters），流動相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀（用磷酸調節pH值至3.0）（13∶87），檢測波長為237nm，室溫，流速：1.0ml·min-1，進樣量10μl，理論板數按維生素B12峰計算不低于2000，空白輔料無干擾。見附圖。

2.2 溶液的制備 （避光操作）

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取維生素B12對照品10.20mg，置200ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取續濾液為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取維生素B12片（25μg）50片，置25ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取廠家提供的空白輔料同法制備。

2.3 線性關系試驗 分別取上述對照品溶液5μl，8μl，10μl，12μl，15μl注入液相色譜儀，每個進樣梯度連續進樣3次，取平均值，以進樣量X（μg）為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，方程為Y=1.162×106X+6.920×103，線性范圍為0.255～0.765μg/ml。

2.4 精密度試驗 取上述對照品溶液10μl，連續進樣6次，維生素B12峰面積相對標準偏差（RSD）為0.27%。

2.5 穩定性試驗 取上述供試品溶液，分別于0，2，4，8小時進樣測定，維生素B12峰面積基本保持不變，RSD為0.87%。

2.6 回收率試驗 取對照品溶液12.5ml，維生素B12片（25μg）25片，置同一25ml容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度。根據峰面積計算其回收率（n=3）為98.5%，RSD為0.08%。

2.7 最低檢測限 將對照品溶液逐步稀釋，以信噪比為3作指標，測得維生素B12的最低檢測限分別為 2ng。

2.8 樣品測定 按上述色譜條件進樣10μl分析，根據標準曲線，3批樣品含量依次為102.5%（n=3，RSD=0.2%）、103.3%（n=3，RSD=0.1%）、102.8%（n=3，RSD=0.2%）。

3 討論

本文采用HPLC法測定維生素B12片含量。本法省去剝糖衣步驟，直接加樣溶于容量瓶中，過濾后測定，減少了避光操作帶來的不便。此法操作方便，快速，重現性好，可用做測定維生素B12含量的方法。