花色苷含量鑒定紅葡萄酒真偽的研究

陳穎秋 馬小星 黃永俊 鄧澤麗

（西南大學，重慶 400715）

花色苷含量鑒定紅葡萄酒真偽的研究

陳穎秋 馬小星 黃永俊 鄧澤麗

（西南大學，重慶 400715）

花色苷是葡萄酒中的一種紅色素，主要存在于葡萄皮中，其骨架是苯并吡喃，通常與一分子葡萄糖結合成糖苷形式。酒齡較低的紅酒中，呈色物質主要是花色苷，花色苷類物質的濃度與組成決定了葡萄酒顏色的深度，而顏色對于葡萄酒的感官質量起著重要作用。對于同一品種的葡萄酒，花色苷的含量在一定范圍內有所增減，一般來說花色苷在新釀制的葡萄酒中含量為200～500mg/L。花色素可與酸性亞硫酸根離子結合成無色絡合物的性質，在添加過量的酸性亞硫酸鹽之后，酒的顏色會發生變化。這種變化是和花色苷的含量成正比例發展。100%葡萄汁釀造的葡萄酒通常在酸性條件下即pH值為4.0左右顯紅色；用堿滴定后，在pH值5.8～6.4范圍內紅色褪盡，酒液呈暗綠色或灰黑色；pH值8.9～10顯示為黑色或深紫色。

紅葡萄酒；花色苷；人工色素；褪色；pH值

紅酒醇厚醉人，卻難以鑒別真偽。同是一瓶芬芳的紅色液體，可能是貨真價實的加州紅酒,也可能是添加了人工色素的紅糖水。根據國際葡萄和葡萄酒組織（OIV，2006）的規定，葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經發酵釀成的酒精飲料。一般來說，市場上的葡萄酒可分為全汁和非全汁兩大類，全汁葡萄酒是指用100%葡萄汁釀造而成的酒，以干紅和干白為代表，是百分之百的純葡萄酒。而非全汁葡萄酒是指用水、酒精、糖精、葡萄香精以及色素、酸、增稠劑、防腐劑等勾兌而成的“葡萄酒”。我國已經明令廢止半汁葡萄酒的行業標準，半汁葡萄酒2007年5月起企業均停止生產；從去年7月1日起市場停止流通。按照《食品添加劑使用衛生標準》及《葡萄釀酒技術規范》的規定，葡萄酒中不允許添加甜蜜素、糖精鈉、某些合成色素、增稠劑等食品添加劑。但是某些葡萄酒生產廠家為了降低生產成本，獲取更多利益，通過添加合成色素、甜蜜素、糖精鈉等減少葡萄汁的用量，損害消費者利益。某些葡萄酒中胭脂紅、檸檬黃、亮藍等人工合成色素嚴重超標。據了解，偽劣葡萄酒色素是從煤焦油中提取的，或以芳烴類化合物為原料合成的，通稱煤焦色素或苯胺色素，對人體有害，危害包括一般毒性、致瀉性、致突性（基因突變）與致癌作用。 因此，真偽葡萄酒的辨別對人體的身體健康具有十分重要的意義。目前各國科學家正在加緊研制紅酒的 DNA鑒別技術，為與造假者較量增添新的有力武器。然而我國關于假葡萄酒的鑒定仍舊處于需求設備高、投入成本大、實驗方法復雜的局面，可操作性對于一般的消費群體和小型企業來說并不強，而本實驗從葡萄酒色素中花色苷的特殊性質與特征反應入手來鑒定其真偽，實驗成本低、簡單而易行，待技術成熟之后，此研究的實際意義和經濟意義非常巨大，現提供兩種方法以供參考。

（一）材料和方法

1.主要實驗材料

市售張裕-麟球特級干紅葡萄酒；純山東蛇龍珠葡萄皮花色苷粉末；分析純；氫氧化鈉溶液；氯化氫溶液；胭脂紅；檸檬黃；焦糖色素。

2.主要實驗儀器

UltraScan PRO光譜光度計；pH S-3C型 酸度計；DJ型精密電子天平。

3.實驗方法

（1）方法一：pH值顯色法

在酸性溶液中，花色苷存在四種主要形式的平衡：藍色醌式堿A，紅色黃烊陽離子AH+，無色甲醇堿或甲醇假堿B，無色查爾酮C。在酸性很強的介質中(pH0.5)，紅色的黃烊陽離子占主導地位。增加pH，黃烊陽離子濃度和顏色強度都會下降，這是由于紅色黃烊陽離子被水的親核攻擊而水合，變成無色甲醇堿。甲醇堿失去A環和B環之間的共軛雙鍵，因此不能吸收可見光。當黃烊陽離子隨pH升高而失去質子時，藍色醌式堿也增加。當pH繼續升高，生成無色甲醇堿，通過開環再生成了查爾酮型。經過測定純花色苷水溶液，檸檬黃，胭脂紅，焦糖色素溶液在不同pH條件下的色度測值（預實驗1）發現，花色苷水溶液在堿性環境中顯黑綠色，添加一定量強酸（如HCL）后可回復本色；檸檬黃溶液在堿性環境中顏色變深，添加一定量強酸之后顏色變淺，但仍比原液深；胭脂紅溶液在堿性環境中顯紫紅色，添加一定量強酸后可恢復本色；焦糖色素溶液在酸堿性條件下顏色變化均不明顯。

①不同比例葡萄酒的配制

配制人工色素混合溶液，經過目測使之從感官上與葡萄酒顏色幾乎無差異，再經色度儀的檢測，確定人工配制色素混合溶液的用量為 0.5g/200ml的焦糖色素溶液 500ml、0.1g/ml的胭脂紅色素溶液200ml、0.1g/ml的檸檬黃色素溶液100ml，并將其混合為800ml的人工色素液。用張裕特選級干紅葡萄酒與之配制成為葡萄酒含量分別0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的混合溶液，分別取30ml于編號為 1至 11的燒瓶中；另外分別配制濃度為0.1mol/L和1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液和氯化氫溶液，記錄室內溫度。

②調節pH

在 pH S-3C型酸度計監測下，使用 1mol/L（粗調）和0.1mol/L（微調）的氫氧化鈉溶液和氯化氫溶液，調節 1至11號溶液的pH值至2（然后重復①，重新配制不同比例的葡萄酒溶液，調節至4，如此重復，調節pH為6、8和10）

③色度值的測定

校正儀器后，選擇透射模式為總透射，分別測量pH值為2、4、6、8、10時的不同比例葡萄酒溶液的L、a、b值。

（2）方法二：焦亞硫酸鈉褪色法

有資料證明，因為花色素可與酸性亞硫酸根離子結合成無色絡合物的性質，再添加過量的酸性亞硫酸鹽之后，酒的顏色發生變化。在選取合適的亞硫酸鹽時，經過對Na2SO3,NaHSO3,Na2S2O3,Na2S2O5等的分別褪色（預實驗2），最終選取焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）作為本實驗的漂白劑。這種白色或黃色結晶的亞硫酸鹽，帶著強烈的SO2氣味，水溶液呈酸性，在食品加工中常作防腐劑、漂白劑、疏松劑。在研究花色苷與人工合成色素的差異性（預實驗3）中，分別在花色苷標樣和幾種人工色素（檸檬黃、胭脂紅等）中添加適量焦亞硫酸鈉，進行充分的溶解。經目測可發現只有花色苷溶液有褪色現象，人工合成色素沒有出現褪色現象；經過色度儀的檢測，人工色素漂白前后光譜圖，即反射率比透射率在不同波長下的曲線也基本重合，沒有變化。根據以上預實驗，決定利用焦亞硫酸鈉能使花色苷退色而不能使人工色素退色的特異性來判斷不同程度“假酒”的色度值特征。

①焦亞硫酸鈉用量的確定

硫的二氧化物和它的類似物可引起花色素苷可逆脫色反應。花色素苷與亞硫酸根離子結合能行程一種物色結合物，可引起一些物質(如葡萄酒)顏色的減退。由于這種變化是可逆的，所以其結合物是不穩定的，等到亞硫酸根離子逐漸減少時，呈色作用逐漸加強，從而使無色變成有色。因為二氧化硫對花色苷的漂白是否可逆反應還有許多疑問。當二氧化硫量在 500～2000ug/g時，這種漂白是可逆的，在后續的加工中，通過大量水洗脫后，顏色可部分恢復。目前，多數學者對不可逆漂白的反應研究較多,認為二氧化硫在果汁的酸作用下形成亞硫酸氫根 ，它對花色苷4一位碳親核攻擊生成了無色的花色苷亞硫酸鹽復合物。為了確定實驗中添加的焦亞硫酸鈉的量，又進行了一組探索實驗（預實驗4），向30ml（352mg/L即張裕麟球特級干紅葡萄酒中花色苷的含量）花色苷溶液中，添加含量梯度增加的焦亞硫酸鈉，進而從顏色和色度儀上觀察得出，1g為合適的反應量。

②不同比例葡萄酒與焦亞硫酸鈉的褪色反應

把葡萄酒用調配好的人工合成色素分別稀釋，使之成為葡萄酒含量分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的混合溶液，分別取 30ml于編號為1至 11的燒瓶中使分別測定其色度值；再將上述溶液分別加入1g焦亞硫酸鈉，充分震蕩溶解進行顏色的褪色漂白。

③色度值的測定

校正儀器后，選擇透射模式為總透射，分別測量不同比例葡萄酒溶液與焦亞硫酸鈉充分反應褪色后的L、a、b值。

（二）結果與討論

1.不同比例葡萄汁的葡萄酒在不同pH條件下的色度值

不同比例葡萄汁的葡萄酒在不同pH條件下的色度值如下圖（圖 1～5）（通過檢驗離群值（t檢驗法），舍去離群值，再取平均值后所得）

圖1

圖2

圖3

圖4

圖5

注：在L,a,b色空間中，L代表亮度（黑白度），從0到100逐漸變亮（變白）；A代表紅綠，以0點為界，正值代表紅色，負值代表綠色；b代表黃藍，以0點為界，正值代表黃色，負值代表藍色。△L為正值表示被測品比樣品偏亮或偏白，為負值表示被測品比樣品偏暗或偏黑。△A為正值表示被測品比樣品偏紅，為負值表示被測品比樣品偏綠。△B為正值表示被測品比樣品偏黃，為負值表示被測品比樣品偏藍。△E為綜合色差值，和亮度差△L，紅綠差△A，黃藍差△B有關。

由圖1、2可知，在pH=2，4時，不同比例葡萄酒的L，a，b三個值均未呈現規律性的變化趨勢，因此說明在pH=2,4時，花色苷的無色結構擬鹽基（AOH）和其紫色結構無水鹽基（AO）之間存在一個隨pH值變化的動態平衡，因pH值較小，花色苷的無色結構（AOH）占有較大比例，葡萄酒的顏色較淺，仍呈現出紅色，原酒與假酒（比例為0%～90%的葡萄酒）未顯現出明顯的差異，因此不能判別真偽。由圖 3、4、5可知，從100%葡萄酒至0%葡萄酒的L，a，b三個值呈現出規律性的上升趨勢，其中又以pH=8，10時的a，b值上升趨勢尤為明顯，在pH=10時，不同比例葡萄汁的葡萄酒隨花色苷含量的減小，L，a,b值呈現出最為明顯的上升趨勢（表1），且△E也呈現出最明顯的上升趨勢（圖6）。當pH值較大時，花色苷的紅色結構花色佯（A+ ）和其無色結構擬鹽基（AOH）之間存在一動態平衡，花色苷的無色結構（AOH）占有較大比例。在堿性環境下，花色苷不穩定，變色導致紅紫色減少甚至消失，顯出灰綠色至墨綠色；而胭脂紅色素和檸檬黃色素在堿性環境下較為穩定，幾乎不變色，在酒樣中依然呈現出原有的顏色，因此原酒與假酒（比例為0%～90%的葡萄酒）出現了明顯的差異，能夠辨別真偽。

表1 不同比例葡萄汁的葡萄酒在pH=10的條件下的色度值

圖6 不同比例葡萄汁的葡萄酒在pH=10時△E變化趨勢圖

2.不同比例葡萄汁的葡萄酒在等量焦亞硫酸鈉褪色作用下的漂白效果

表2 不同比例葡萄酒漂白前后的色度值比較

注：ΔE* (總色差) 是基于 L*、a*、b* 色差，并可以作為一個單獨的指標來表示。在國家標準中，有總色差的計算公式：ΔE*＝（ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2）1／2，其中，ΔL*、Δa*、Δb*為前后兩組數據的差值。△E*的趨勢變化：在對稀釋不同倍數的葡萄酒漂白前后色差的整理，可以得到△E*的趨勢變化圖（見圖7）。

圖7

隨著葡萄酒稀釋倍數的增加，葡萄汁含量的減少，色差值逐漸變小，即漂白前后的差異性變小。并且，從趨勢圖中可以明顯發現數據間存在線性關系，這在一定程度上也顯示了花色苷含量對漂白作用的單一影響性。但通過以上原理鑒別葡萄酒真偽存在一定的局限性。除了人工合成色素外，還有一些是利用葡萄皮天然色素和葡萄汁色素來達到葡萄酒的完美色澤。雖然國內廠家更多的使用廉價的人工合成色素，但是并不能排除其他天然色素的添加，而這部分并不能簡單的根據焦亞硫酸鈉的漂白退色方法來鑒別。此外，在實驗進行過程中，焦糖色素的特別性也不能完全忽視，通過色度儀的測定，發現焦糖色素在添加焦亞硫酸鈉前后的光譜圖曲線有所不同，并不是完全不受外界條件的影響。在探索這個方面的原因時，發現這種色素非常特別，至今為止，科學技術尚不能確切的解釋焦糖反應的機理，焦糖的結構組成也尚未被認識。并且根據不同的添加要求，這種色素的制備和生產也有不同，這在一定程度上，給我們探索帶來了誤差和不確定性。

（三）結論

1.在PH 值的影響下，單體花色素苷涉及到一種動態平衡而影響到酒的顏色：花色烊A（flavyliunion）紅色分子結構與無色分子結構“擬鹽基”AOH（pseudoase，2-苯基苯吡南）之間的動態平衡。pH 值越高，平衡向花色烊A 方向移動，故酒的顏色越深。未添加人工色素的葡萄酒通常在酸性條件下即 pH 值為 4.0 左右顯紅色; 用堿滴定后, 在 pH 值 5.8～6.4 范圍內紅色褪盡,酒液呈暗綠色或灰黑色; pH 值8.9-10顯示為黑色或深紫色；反之在pH 值5.8～ 6.4范圍內紅色不褪盡, pH 值8.9～10，直接轉為紫色或玫瑰紅色的酒樣，可判定該樣品添加了人工合成色素。由方法一的結果和分析可知，調pH值不失為檢驗紅葡萄酒真偽的一個簡易、快速的方法，本探索實驗將探索檢驗假酒最合適的pH范圍初步定于8至10之間，有待更深入的研究與探索。

2.亞硫酸離子（SO3H-）與花色素苷接合存在另一種動態平衡。這個反應是可逆的，能夠引起酒顏色的減退，而形成一種無色的結合物。方法二可以為葡萄酒真偽的辨別提供標準，測定葡萄酒的漂白前后的色度差時，不僅可以測得葡萄酒的真偽，甚至可以基本辨別葡萄酒加入人工合成色素的程度。

3.為驗證本實驗的可靠性與嚴謹性，另外選用了長城特級干紅葡萄酒、王朝干紅葡萄酒、通化精選干紅葡萄酒進行相同對比實驗，所得結果一致，充分說明了該實驗方法的可靠性。

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TS262.6

A

1008-1151(2011)06-0094-03

2011-03-18

陳穎秋（1988－），女，廣西欽州人，西南大學在讀生，研究方向為食品加工；黃永俊（1987－），男，安徽蕪湖人，西南大學在讀生，研究方向為食品科學；馬小星（1989－），女，山西襄垣人，西南大學在讀生，研究方向為食品安全；鄧澤麗（1989－），女，四川宜賓人，西南大學在讀生，研究方向為食品安全與質量控制。