一種新型殼聚糖分離介質的制備

易 喻，崔國艷，王 鴻，李 敏，朱克寅，應國清

（1浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310032，2杭州博林生物技術有限公司，浙江 杭州 310018）

研究開發(fā)

一種新型殼聚糖分離介質的制備

易 喻1，崔國艷1，王 鴻1，李 敏1，朱克寅2，應國清1

（1浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310032，2杭州博林生物技術有限公司，浙江 杭州 310018）

以殼聚糖為載體、液體石蠟為分散介質、戊二醛為交聯(lián)劑、Span80 為乳化劑，采用反相懸浮法制備殼聚糖微球，以環(huán)氧氯丙烷為活化劑、亞氨基二乙酸為螯合配基制備新型殼聚糖分離介質，并研究分離介質制備過程中各參數(shù)對殼聚糖分離介質性能的影響。確定最佳活化工藝為：40% DMSO/NaOH（0.6 mol/L）、ECH體積分數(shù)10%、反應溫度40 ℃、反應時間4 h，測得環(huán)氧基修飾密度可達到0.15 mmol/g（gel）；最佳螯合工藝：IDA（0.6 mol/L）/ NaOH（2.0 mol/L）混合液，反應時間為6 h，制備的新型殼聚糖分離介質對Cu2+吸附量達到172.787 g/g gel，殼聚糖分離介質含水率為45.60%，孔隙率為69.45% ，得到一種新型金屬螯合層析填料。

殼聚糖；金屬螯合層析填料；環(huán)氧氯丙烷

固定化金屬螯合親和層析（immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）是近二十年發(fā)展起來的一項新型分離技術。該法最早由 Porath等[1]提出，其主要是利用蛋白質表面的一些氨基酸，如組氨酸、色氨酸、賴氨酸等能和金屬離子發(fā)生特殊的相互作用，從而對蛋白質加以分離。IMAC具有螯合介質制備簡單方便、交換載量大、分離條件溫和、通用性強、易于放大，特別是在蛋白的純化過程中，其溫和的洗脫條件，可較好的保持蛋白的生物學活性等優(yōu)點，使得其應用越來越受到重視，將成為蛋白質純化中最具潛力的層析方法[2-3]。

開發(fā)新型性能良好、適于蛋白質分離的固定化金屬螯合分離介質具有重要的意義[4]。殼聚糖作為產(chǎn)量僅次于纖維素的天然高分子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖，其分子鏈上豐富的羥基和氨基使其易于進行化學修飾而賦予多種功能[5]，近年來由于其無毒性及較好的生物相容性和生物降解性[6]，在醫(yī)藥、食品、環(huán)保、輕工、農(nóng)業(yè)等方面獲得廣泛的應用[7]。如將殼聚糖制備成單分散的窄分布高分子微球，使殼聚糖和高分子微球的功能相結合，使其在蛋白分離中得到更大的應用[8]。

本文選用殼聚糖為基質載體、戊二醛為交聯(lián)劑、環(huán)氧氯丙烷為活化劑、亞氨基二乙酸（IDA）為鰲和配基制備新型殼聚糖分離介質，并研究了制備過程中各因素對殼聚糖介質吸附性能的影響，從而確定出最佳的制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（脫乙酰度≥95%，浙江金殼生物化學有限公司，Mw為300 kDa）、冰乙酸、NaOH、液體石蠟、環(huán)己烷、戊二醛溶液（25%，體積比）、環(huán)氧氯丙烷、亞氨基二乙酸、二甲基亞砜等，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖介質的制備

（1）交聯(lián) 將適量殼聚糖溶解在100 mL質量分數(shù)為2%的乙酸溶液中，室溫下靜置過夜，備用。于裝有機械攪拌器及溫度計的500 mL 三口瓶內(nèi)，依次加入液體石蠟、環(huán)己烷和少許Span 80 ，攪拌0.5 h 后，加入上述殼聚糖溶液，用水浴鍋將體系加熱至55 ℃，攪拌1 h，恒壓滴液漏斗緩慢滴加質量分數(shù)為25% 的戊二醛；用10% NaOH 溶液調(diào)pH值至10 ，然后升溫至65 ℃，繼續(xù)反應3 h后，趁熱用真空抽濾泵將得到的微球濾出，用蒸餾水反復水洗后，再在圓底燒瓶中加150 mL 石油醚，用索氏提取器抽提，然后用無水乙醇索氏抽提，晾干、真空干燥至恒重，制得殼聚糖微球[9-10]。

（2）活化 稱取一定量殼聚糖微球，經(jīng)水充分溶脹后，依次用20%、50%、70%的DMSO水溶液清洗；向處理后的產(chǎn)物中加入一定量的DMSO/NaOH溶液和環(huán)氧氯丙烷，振蕩反應一定時間。反應結束后用大量蒸餾水沖洗，直至清洗液中無環(huán)氧基檢出。其中，殼聚糖環(huán)氧基修飾密度采用硫代硫酸鈉滴定法測定[11]。

（3）鍵合螯合配基 取 50 mL一定濃度的IDA/NaOH混合溶液加入到活化后的殼聚糖微球中，在水浴搖床中振蕩反應一定時間，洗滌至中性，用布氏漏斗抽干，得適于蛋白質分離的殼聚糖介質。

（4）金屬離子螯合 取殼聚糖分離介質裝柱（1.0 cm × 15 cm），用0.1 mol/L的CuSO4溶液灌流，分離柱螯合銅離子至飽和后用0.05 mol/L pH值7.5 Tris-HCl緩沖液清洗，可得到螯合銅離子的殼聚糖分離介質。

1.2.2 殼聚糖分離介質孔度值（P）的表征[12]

于比重瓶中加滿正庚烷并稱重（W1），倒出正庚烷，加入一定量干燥過的交聯(lián)殼聚糖樹脂（W），將樹脂在正庚烷中浸泡2 h后，用正庚烷加滿比重瓶并稱重（W2），則干燥過的樹脂骨架體積見式（1）。

式中，dt為測定溫度下正庚烷的密度，dt= 0.6830 g/cm3，骨架密度見式（2）。

另外稱取一定量的水溶脹后的交聯(lián)殼聚糖樹脂（盡量吸干表面水分）于烘箱中烘至恒重（G），則樹脂中水分所占的質量分數(shù)為式（3）。

樹脂的孔度值可用式（4）計算。

1.2.3 環(huán)氧基修飾密度的定量分析

殼聚糖介質的環(huán)氧基修飾密度采用硫代硫酸鈉滴定法[13]測定，經(jīng)去離子水清洗后的活化介質用布氏漏斗抽干，隨后稱取0.5 g置于磨口錐形瓶中并加入約5 mL1.3 mol/L硫代硫酸鈉和酚酞指示劑1～2滴，錐形瓶封口后置于室溫下振蕩反應30 min，反應后的溶液用0.1 mol/L鹽酸標準溶液滴定，直至溶液由紅色變?yōu)闊o色為止，根據(jù)消耗的鹽酸標準溶液的體積，由式（5）計算環(huán)氧基修飾密度。

式中，S為環(huán)氧基修飾密度，mmol/g；MHCl為 HCl濃度，mol/L；V0、V1分別為滴定前、后 HCl的體積，mL；ρ為介質密度，1.02 g/mL。

1.2.4 Cu2+螯合量的測定

稱取一定量的殼聚糖介質，加入 10 mL 0.4 mol/L的CuSO4溶液，置于搖床中振蕩反應一定時間，真空抽濾后利用分光光度法[14]測定濾液中Cu2+含量，即可確定Cu2+螯合量。

2 結果與分析

2.1 實驗參數(shù)對殼聚糖成球的影響

2.1.1 戊二醛濃度對殼聚糖微球制備的影響

當殼聚糖在酸性條件下交聯(lián)時，會因分子中的—NH2被質子化形成—NH3+而溶于水造成分離介質的流失，影響其性能，也不利于再生，因此可用戊二醛進行交聯(lián)，使原來無序線狀分子形成立體網(wǎng)孔狀結構，從而提高吸附效率[15-16]。

將殼聚糖的濃度固定為 3%，液體石蠟與殼聚糖溶液的比例定為1∶1，環(huán)己烷15 mL，以不同體積的戊二醛進行交聯(lián)，其它條件不變進行實驗，結果見圖1。

實驗結果表明（圖 1），交聯(lián)劑對殼聚糖的成球有重要影響。戊二醛用量增大，使得表面交聯(lián)層增厚，導致產(chǎn)物顏色加深，黏著嚴重，微球交聯(lián)過于致密，多孔性降低，從而使得微球的孔隙率降低，但戊二醛加量太少，殼聚糖形成的球形不好。因此，綜合考慮，當戊二醛加量為 3 mL時，這時殼聚糖微球球形較好，測得的殼聚糖微球含水率為60.07%，孔隙率為53.92%，并且分布粒度較窄。

2.1.2 攪拌速度對微球成球性及粒度大小的影響

固定其它實驗條件不變，改變反應體系的攪拌速度進行實驗，結果見圖2。

高速公路隧道工程施工難度系數(shù)比較高，各種不確定情況發(fā)生的概率也比較高，高速公路隧道施工的特殊性是比較明顯的。為了切實提升高速公路隧道項目的施工質量，要根據(jù)實際情況對施工方案更加優(yōu)化，同時選擇最合適的施工技術。

圖1 戊二醛對殼聚糖交聯(lián)的影響

圖2 攪拌速度對殼聚糖交聯(lián)的影響

由圖2可以看出，攪拌速度對殼聚糖成球以及顆粒大小有重要影響，攪拌過快，雖然成球粒徑分布較窄，微球孔隙率降低；攪拌過慢，成球性降低；這主要是因為當攪拌速度提高時，分散介質中的殼聚糖液滴粒徑減小，液滴數(shù)目增多，比表面積增大，與交聯(lián)劑接觸面積增加，導致交聯(lián)致密。綜合考慮，只有當轉速為400 r/min 時，對殼聚糖成球最有利，此時測得的殼聚糖微球孔隙率為53.47%。

2.2 殼聚糖介質的性能測定

經(jīng)上述各條件實驗，交聯(lián)劑用量為3 mL、攪拌速度為400 r/min時，得到產(chǎn)物的掃描電鏡圖見圖3。

圖3中，殼聚糖微球有個別出現(xiàn)凹陷現(xiàn)象，可能是在制備過程中，殼聚糖微球表面附著了極細的殼聚糖珠體，但在后續(xù)處理過程中脫落。

2.3 活化條件的確定

2.3.1 DMSO對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別加入體積分數(shù)（φ）為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的DMSO與NaOH（1 mol/L）的混合溶液進行反應，結果見圖4。

圖3 殼聚糖微球的掃描電鏡圖（×100）

圖4 φDMSO對環(huán)氧基修飾密度的影響

由圖4可知，隨著反應體系中DMSO含量的增大，環(huán)氧基修飾密度有所提高，當DMSO體積分數(shù)達到0.4后殼聚糖微球的環(huán)氧基密度趨于穩(wěn)定。這可能是由于溶劑效應造成的。因為DMSO能與環(huán)氧氯丙烷互溶，使整個反應體系處于均相，從而使得環(huán)氧基密度增加。環(huán)氧氯丙烷作為一種常用的活化試劑，其在水溶液中有限的溶解度以及由此引發(fā)的其在殼聚糖微球中的低擴散通量是引起活化時間長、活化密度低的重要因素之一。本實驗通過在活化體系中引入水溶性有機試劑提高環(huán)氧氯丙烷在活化體系中的溶解度，以期強化環(huán)氧氯丙烷活化反應；而DMSO不僅與水完全混溶，而且對于多種配基亦有很好的溶解性，這對獲得高配基修飾密度是至關重要的。

2.3.2 NaOH 濃度對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別加入濃度為0、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L的NaOH與DMSO（φDMSO為0.4）的混合溶液進行反應，結果見圖5。

由圖5可知，NaOH濃度對活化程度也有影響，隨著NaOH濃度增加，環(huán)氧基修飾密度先上升后降低，但在濃度為0.6 mol/L時，環(huán)氧基密度達到最大，這可能是由于堿濃度過高會導致殼聚糖分離介質上的環(huán)氧基開環(huán)所致。

圖5 NaOH濃度對環(huán)氧基修飾密度的影響

2.3.3 環(huán)氧氯丙烷加量對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別加入體積分數(shù)φECH為5%、10%、15%、20%、25%的ECH進行反應，結果見圖6。

由圖6可知，隨著ECH濃度的增加，環(huán)氧基活化密度有所增加，當其體積分數(shù)達到10%之后，環(huán)氧基修飾密度趨于穩(wěn)定，這與水溶液體系中的結果是一致的[16]。

2.3.4 反應時間對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別反應2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，其結果見圖7。

由圖7可知，環(huán)氧基修飾密度隨著反應時間的延長而增加；在4 h以后開始有所下降，此時活化反應基本完成，但 ECH在堿性條件下因為發(fā)生水解而失活，導致測定的環(huán)氧基有所下降。

2.3.5 反應溫度對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別在20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃條件下進行反應，反應結果見圖8。

由圖8可知，環(huán)氧基修飾密度隨著反應溫度的升高有明顯的降低，反應溫度達到 40 ℃時達到最大值，可能是由于溫度升高，使得殼聚糖微球本身發(fā)生了降解。

圖6 φECH對環(huán)氧基修飾密度的影響

圖7 反應時間對環(huán)氧基修飾密度的影響

圖8 反應溫度對環(huán)氧基修飾密度的影響

綜合以上反應條件可知，活化的最佳工藝為：DMSO體積分數(shù)為0.4、NaOH濃度為0.6 mol/L、ECH體積分數(shù)為10%、反應4 h、反應溫度為40 ℃，此時環(huán)氧基修飾密度可達到0.15 mmol/g。

2.4 螯合配基反應條件的影響

2.4.1 螯合配基濃度的影響

稱取0.5 g活化好的殼聚糖微球，分別加入濃度為0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L IDA與NaOH（濃度為1.0 mol/L）的混合溶液，置于60 ℃水浴搖床中反應4 h，洗滌、抽濾。測定Cu2+的螯合量，結果見圖9。

由圖9可知，隨著IDA濃度的增加，Cu2+吸附量逐漸增加，當其濃度達到0.6 mol/L之后，Cu2+吸附量趨于穩(wěn)定，由此可間接反映螯合配基已達到飽和。

2.4.2 NaOH濃度對反應的影響

稱取0.5 g活化好的殼聚糖微球，分別加入濃度為0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L NaOH與 IDA（濃度為 1.0 mol/L）混合溶液，置于60 ℃水浴搖床中反應4 h，洗滌、抽濾。測定Cu2+的螯合量，結果見圖10。

由圖10可以看出，隨著NaOH濃度的增加，Cu2+螯合量先增加后趨于平穩(wěn)。

圖9 IDA濃度對Cu2+螯合量的影響

圖10 NaOH濃度對Cu2+螯合量的影響

2.4.3 時間對反應的影響

稱取0.5 g活化好的殼聚糖微球，加入濃度為0.4 mol/L IDA與濃度為1.0 mol/L NaOH混合溶液，置于60 ℃水浴搖床中分別反應2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，洗滌、抽濾。測定Cu2+的螯合量，結果見圖11。由圖11可知，隨著反應時間的延長，Cu2+的螯合量先增加后降低。

綜上所述，殼聚糖介質最佳的制備工藝為：IDA濃度為0.6 mol/L，NaOH濃度為2.0 mol/L，60 ℃水浴搖床170 r/min，反應6 h，制備的新型殼聚糖分離介質對Cu2+吸附量達到172.787 g/g。

3 結 論

以殼聚糖為載體，環(huán)氧氯丙烷為活化劑，亞氨基二乙酸為金屬螯合配基制備新型殼聚糖分離介質，對分離介質的制備過程、活化過程以及螯合配基過程的工藝參數(shù)進行優(yōu)化以確定出最優(yōu)的制備工藝。

（1）采用1.0 mL/g（殼聚糖）戊二醛對殼聚糖在攪拌速度為400 r/min條件下進行交聯(lián)，可以制得殼聚糖微球呈紅棕色，成球率可達到90%以上，球形好、分布窄的殼聚糖微球。其含水率為45.60%、孔隙率為69.45%。

圖11 反應時間對Cu2+螯合量的影響

（2）活化工藝：通過引入親水性溶劑DMSO，可消除殼聚糖微球與環(huán)氧氯丙烷的相界面，促進活化試劑的溶解，提高了殼聚糖微球的環(huán)氧基修飾密度。DMSO 體積分數(shù)為 0.4、NaOH濃度為 0.6 mol/L、ECH體積分數(shù)為10%、反應4 h、反應溫度為 40 ℃，此時環(huán)氧基修飾密度可達到 0.15 mmol/g。

（3）螯合工藝：IDA濃度為0.6 mol/L，NaOH濃度為2.0 mol/L，60 ℃水浴搖床170 r/min，反應6 h，制備的新型殼聚糖分離介質對Cu2+吸附量達到172.787 g/g。

該法制備的新型殼聚糖分離介質可用于固定化金屬螯合層析填料。

[1]Porath J，Cadsson J，Olsson I，et al．Metal chelate affinity chromatography：A new approach to protein fractionation[J]．Nature，1975，258：598-599．

[2]Vladka Gaberc Porekar，Viktor Menart．Perspectives of immobilizedmetal affinity chromatography[J]．Biochemical and Biophysical Methods，2001，49：335-360．

[3]李蓉，陳國亮，趙文明．固定金屬離子親和色譜[J]．化學通報，2005（5）：352-360．

[4]葉青，王守斌，葉文玉．新型固定金屬離子親和吸附劑的制備及對蛋白質的吸附研究[J]．河南大學學報：自然科學版，2007（2）：152-156．

[5]Marguerite Rinaudo．Chitin and chitosan：Properties and applications [J]．Progress in Polymer Science，2006，31：603-632．

[6]Chen Xiguang，Liu Chengsheng，Liu Chenguang，et al．Preparation and biocompatibility of chitosan microcarriers as biomaterial [J]．Biochemical Engineering Journal，2006，27：269-274．

[7]李學斌，祝華．殼聚糖微球的制備方法研究[J]．藥學進展，2005，29（4）：166-169．

[8]李志洲，劉軍強．多孔殼聚糖微球的制備研究[J]．淮陰師范學院學報：自然科學版，2007，6（3）：247-250．

[9]余藝華，孫彥．交聯(lián)殼聚糖樹脂的制備工藝及性能表征[J]．天津大學學報，2000，33（1）：113-117．

[10]孟范平，易懷昌．殼聚糖微球的制備及其對酸性染料的吸附性能[J]．化工進展，2009，28（10）：1861-1871

[11]史清洪，彭冠英，孫舒，等．環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠過程強化及性能評價[J]．過程工程學報，2007，7（4）：743-746．

[12]王永健，孫彥．適于蛋白質吸附的交聯(lián)殼聚糖樹脂的制備[J]．天津大學學報，2001，34（6）：819-822．

[13]Judith A Scoble，Robert K Scopes． Assay for determining the number of reactive groups on gels used in affinity chromatography and its application to the optimization of the epichlorohydrin and divinylsulfone activation reactions[J]．Journal of Chromatography A，1996，752：67-76．

[14]Zhao Fan，Yu Binyu，Yue Zhengrong，et al．Preparation of porous chitosan gel beads for copper（Ⅱ） ion adsorption[J]．Journal of Hazardous Materials，2007，147：67-73．

[15]Biróa(chǎn) E，Németha Sz A，F(xiàn)eczkóa(chǎn) T．Three-step experimental design to determine the effect of process parameters on the size of chitosan microspheres[J]．Chemical Engineering and Processing，2009，48：771-779．

[16]Dhananjay S K，Mulimani V H．Evaluation of modifed chitosan as matrix for hydrophobic interaction chromatography[J].Process Biochemistry，2008，43：647-653．

Study the preparation of a novel crossl-linked chitosan support

YI Yu1，CUI Guoyan1，WANG Hong1，LI Min1，ZHU Keyin2，YING Guoqing1
（1College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，Zhejiang，China；2Hangzhou Bolin Biotechnolgy Co. Ltd.，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

Investigation was carried out to elucidate the infuence of process parameters on the characteristics of chitosan microspheres prepared by reverse phase suspension cross-linked polymerization. The chitosan droplet solidifed and hardened by glutaraldehyde crosslinking agent was dispersed in the oil phase composed of liquid paraffin in the presence of Span 80 surfactant. Iminodiacetic acid（IDA）was attached onto chitosan microspheres activated by epichlorohydrin under basic condition. The results indicated that the optimal epoxy density above 0.15 mmol/g gel was achieved at 10%（φ）epichlorohydrin as activating accelerator in the solution consisting of 0.6 mol/L NaOH and 40% DMSO. The study on linkaging of IDA demonstrated that the support was synthesized in the solution composed of 0.6 mol/L IDA and 2.0 mol/L NaOH at 60 ℃ for 6 h，whose adsorption of Cu2+was up to 172.787 g/g gel. The moisture content of the matrix was up to 45.60% and the porosity was 69.45% under the optimized conditions. The novel matrix could be used in immobilized metal ion affinity chromatography as the solid phase.

chitosan；metal chelate affinity chromatography；epichlorohydrin

O 63

A

1000-6613（2011）09-2049-06

2011-02-25；修改稿日期2011-03-25。

浙江省科技廳項目（2009C33089）。

易喻（1978 —），男，講師，研究方向為生化分離工程及酶工程。聯(lián)系人：應國清，教授，博士生導師。E-mail gqying@zjut.edu.cn。