熒光素酶標記人胃癌細胞裸鼠原位移植模型的建立

李小穎，董 偉，張連峰

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021;2.國家中醫藥局人類疾病動物模型3級實驗室，北京 100021)

熒光素酶標記人胃癌細胞裸鼠原位移植模型的建立

李小穎1，董 偉1，張連峰2

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021;2.國家中醫藥局人類疾病動物模型3級實驗室，北京 100021)

目的 建立熒光素酶標記人胃癌原位異種移植模型。方法 將螢火蟲熒光素酶作為標記基因導入人胃癌MGC803細胞，建立穩定表達熒光素酶的細胞，將其接種裸鼠胃壁漿膜下，建立胃癌裸鼠原位腫瘤模型。用活體熒光成像系統檢測腫瘤的發生發展，并進行小動物超聲影像和病理學分析。結果 裸鼠原位成瘤率為100%，活體熒光成像觀察發現在接種第7天，就可以觀察到腫瘤發光。21 d后腫瘤進入對數生長期，28 d后腫瘤出現明顯壞死，平均熒光光子數呈現下降趨勢。超聲成像發現小鼠胃部有直徑為8.39 mm，面積為28.92 mm2瘤塊。結論熒光素酶標記可以實時監測原位異種移植人胃癌生長狀況。

人胃癌細胞;腫瘤模型;熒光素酶;生物發光;小動物超聲

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國其 發病率居各類腫瘤的首位，胃癌可發生于任何年齡，每年約17萬人死于胃癌。理想的胃癌裸小鼠人類腫瘤動物模型是研究腫瘤生長和轉移生物學以及尋求抗癌新藥和新方法的重要工具。人胃癌裸鼠原位移植模型自1993年 Furukawa等［1］首次報道建立后，逐漸被應用于胃癌的浸潤轉移機制及抗胃癌轉移藥物的研究。但傳統的動物模型由于缺乏理想的細胞標記，不易實時記錄腫瘤生長情況及評價抗腫瘤藥物治療效果［1-3］。生物發光成像技術是利用底物熒光素在熒光素酶(luciferase，Luc)標記的腫瘤細胞中，能夠被穩定表達的熒光素酶催化而發光，在活體動物水平觀察腫瘤變化情況的一種新技術，廣泛用于腫瘤生長的示蹤和治療效果的評價。

本實驗利用螢火蟲熒光素酶基因標記人胃癌細胞MGC803，并建立表達熒光素酶的人胃癌裸鼠原位移植模型，利用生物發光成像技術對此模型內的腫瘤生長進行非侵入性的連續監測，以便建立便于即時監測胃癌生長和藥物治療效果評價的生物發光模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：人胃癌細胞MGC803凍存于本實驗室，L-谷氨酰胺、雙抗、DMEM、胎牛血清(Gibco公司)、G418(Amresco公司)、脂質體 2000(Invitrogen公司)。活體熒光影像系統(I.C.E.，日本 Roper公司)、倒置顯微鏡(Nikon TS100)。Vevo770TM小動物超聲探測系統(加拿大VisualSonics公司)。

1.1.2 實驗動物：BALB/cA-nu裸小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［XCXK(京)2007-0001］，鼠齡5周，體重15～18 g，在本實驗室無特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的飼養間(SYXK(京)2009-0003)飼養。所有實驗操作程序均經過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(批準號為GC-09-2001)。1.2 方法

1.2.1 細胞培養：用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養基作為MGC803細胞的培養液，于5%CO2，37℃細胞培養箱內常規培養。

1.2.2 構建帶有篩選標記的載體：pCAGGS-Neo-Luc由本實驗室構建［4］。

1.2.3 細胞轉染和篩選：采用脂質體2000轉染MGC803細胞(具體轉染步驟參照脂質體2000操作說明)。轉染后24 h，用含1 000 μg/mL G418的培養液篩選細胞，直至形成肉眼可見的單克隆，挑取單克隆于96孔板，于5%CO2，37℃細胞培養箱內培養，匯合度達70% ～90%后，傳代(1：2傳代)，取其中一塊96孔板加入用DMEM配置的底物luciferin(1 mg/mL)20 μL，放入活體熒光影像系統攝像15 min，Slide Book 4.0軟件進行分析。

1.2.4 裸鼠胃癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察：收集處于生長對數期的轉染細胞，稀釋至2×106cells/mL。取250 μL細胞懸液接種于已禁食24 h的裸鼠胃壁漿膜下，并可見漿膜下鼓起一透亮小泡為標志，共接種3只。分別在接種的7、14、21、28和35 d觀察腫瘤的生長情況。觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物(1.5 mg/10 g)，飽和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放入活體熒光影像系統攝像，Slide Book 4.0軟件進行分析。以腫瘤細胞發射的光子數對小鼠荷瘤時間作圖，得到熒光素酶標記腫瘤細胞在裸鼠體內的生長曲線。

1.2.5 超聲圖像采集：腫瘤長到第五周時，用三溴乙醇注射麻醉后(0.18 mL/10 g體重)，置于檢測臺上，將臺溫設定為40℃，小鼠四肢用醫用膠布固定于涂有導電膠的電極上，記錄生理指標。用VisualSonics? Vevo770?操作系統和專門用于小鼠的RMV704高頻超聲探頭，進行 B型檢測。通過VisualSonics?Vevo770?高分辨率小動物超聲系統的軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 穩定高表達Luc的單克隆細胞株

獲得穩定表達熒光素酶基因的細胞克隆(圖1箭頭所示)，經過多次傳代表達水平穩定，標記細胞的形態、生長方式、生長速度等與未轉染細胞無明顯差異。

2.2 Luc標記MGC803小鼠胃癌原位腫瘤模型的動態觀察

從圖2可見腫瘤接種第7天，就可以觀察到腫瘤發光，隨著觀察天數的增加，發光強度增強。圖3發現腫瘤接種21 d后進入對數生長期，28 d后腫瘤的發光強度逐漸減弱，推測腫瘤出現了壞死。

2.3 小動物超聲影像學和病理學觀察

腫瘤接種35 d后，超聲成像發現小鼠胃部有直徑為8.39 mm，面積為28.92 mm2瘤塊(圖4A)。脫頸處死小鼠并解剖，暴露胃部，發現胃上有灰白色的腫瘤組織，表面呈結節狀，質地較硬(圖4B)，(圖1，2，4 見封三)。

3 討論

原位胃癌腫瘤模型已經在實驗研究中顯示出其優勢，尤其移植模型的方法改進已經使其成為聯系實驗和臨床的工具。1993年，Furukawa等［1］首次報道將組織學完整的瘤組織縫掛于裸鼠胃壁，建立人胃癌原位移植模型，該模型能動態反映胃癌從原位生長、局部浸潤到遠處轉移的發展過程，是研究胃癌的生長和轉移特點的良好模型。1997年，汪芳裕等［2］首次采用荷包縫合的方法，在裸鼠胃壁縫制粘膜小囊包埋腫瘤組織，建立原位腫瘤移植模型，克服了組織縫掛法的瘤組織早期未與胃壁粘膜接觸的缺點。2005年，陳亞琳等［3］將手術方法經適當的改進，采用OB膠粘貼法將完整的瘤組織粘貼于裸鼠胃壁，建立人胃癌原位移植模型，該模型取代了胃囊法，既有胃囊法的優點，又操作相對簡便，對裸鼠的創傷小。近些年來國內外學者主要集中于上述三種移植模型的方法研究［5-8］。但是由于腫瘤組織在體內不便監測，不能對腫瘤生長進行連續監測，需要在不同時間點犧牲小鼠、解剖、染色、病理分析等實驗過程。

本實驗利用螢火蟲熒光素酶基因標記人胃癌細胞MGC803，使胃癌細胞成為發光源，然后將其原位接種裸鼠胃壁漿膜下，用活體熒光成像系統連續觀察胃癌細胞在裸鼠體內的生長情況，發現在接種的第7天，就可以觀察到腫瘤發光，21 d后腫瘤進入對數生長期，28 d后腫瘤的發光強度減弱，推測腫瘤出現了壞死。腫瘤接種35 d后，超聲成像發現小鼠胃部有直徑為8.39 mm，面積為28.92 mm2瘤塊。另外解剖學觀察，進一步驗證了該方法的可行性。此模型克服了以往胃癌模型不宜動態觀察的不足，應用該模型能夠更準確地反映腫瘤生長的實際情況，使實驗動物的用量大為減少，有效排除了動物個體間差異的影響，可對癌癥治療之前和過程中的癌細胞變化進行實時觀測和評估，熒光素酶標記的人胃癌原位轉移模型是研究胃癌原位轉移簡便可行的新方法。

［1］ Furukawa T，Fu XY，Kubota T，et al.Nude mouse metastatic models of human stomach cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intact tissue ［J］.Cancer Res，1993，53：1204-1208.

［2］ 汪芳裕，朱人敏，王琳，等.建立裸小鼠人胃癌原位移植模型的一種新方法［J］. 金陵醫院學報，2007，10(2)：238-240.

［3］ 陳亞琳，魏品康，許玲，等.采用 OB膠粘貼法建立人胃癌裸鼠原位種植轉移模型［J］. 癌癥，2005，24(2)：246-248.

［4］ 李小穎，高凱，董偉，等.熒光素酶標的人肝癌細胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發光成像和 PET-CT成像比較［J］.中國比較醫學雜志，21(3)：10-13.

［5］ 楊波，脫帥，脫朝偉，等.原位移植體內連續篩選法建立人胃惡性淋巴瘤裸小鼠高轉移模型系統［J］.中華醫學雜志，2010，90(6)：413-417.

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Establishment of a Human Gastric Cancer Orthotopic Transplantation Model Labeled with Luciferase

LI Xiao-ying1，DONG Wei1，ZHANG Lian-feng1，2
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China;2.Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021)

Objective To establish a human gastric cancer orthotopic xenograft model labeled with luciferase.Methods Luciferase labeled MGC803 cells were cloned with G418 selection(MGC803-Luc).MGC803-Luc cells were implanted into the stomach wall of BALB/cA-nu mice to establish the tumor-bearing mouse models.Whole-body optical imaging technique was used to monitor the growth of the implanted tumor.Results The successful rate of orthotopic transplantation was 100%.The whole-body optical imaging found that the fluorescence could be detected at 7 days after transplantation.The tumor growth became logarithmic after 21 days.However，the mean fluorescent intensity tended to decline when the tumor had apparent necrosis after 28 days.Ultrasonic imaging found a tumor on the stomach，approximately 8.39 mm in diameter and 28.92 mm2in area.Conclusions It is possible to real-time monitoring the growth of human gastric cancer labeled with luciferase in animals.

Human gastric carcinoma;Tumor model;Luciferase;Bioluminescent imaging;Small-animal ultrasound

R33

A

1671-7856(2011)04-0028-03

2010-10-09

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.007

衛生部項目，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

李小穎(1981-)，女，實習研究員。E-mail：lixiaoyinghebei@163.com。

張連峰，E-mail：zhanglf@cnilas.org。