PCR-DGGE技術(shù)分析塔式蚯蚓生態(tài)濾池微生物群落結(jié)構(gòu)

郭飛宏,鄭 正,張繼彪(.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 0093；.復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,上海 00433)

PCR-DGGE技術(shù)分析塔式蚯蚓生態(tài)濾池微生物群落結(jié)構(gòu)

郭飛宏1,鄭 正2*,張繼彪2(1.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210093；2.復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,上海 200433)

利用PCR-DGGE技術(shù)研究塔式蚯蚓生態(tài)濾池微生物群落結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果表明,微生物的變化與濾池體積大小、水力停留時(shí)間和污染物負(fù)荷有關(guān),微生物群落結(jié)構(gòu)在不同濾池層中變化較大.12個(gè)樣品泳道中的總細(xì)菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)從0.25變化到1.27,一級(jí)濾池微生物多樣性指數(shù)從0.29變化到1.05,二級(jí)濾池微生物多樣性指數(shù)從0.75變化到0.97,三級(jí)濾池微生物多樣性指數(shù)先從0.87減少到0.25,后由于葡萄糖的加入增加到 1.27.二級(jí)濾池出水中葡萄糖的加入,加強(qiáng)了系統(tǒng)內(nèi)微生物的活性,從而三級(jí)濾池砂石和青石層細(xì)菌條帶變亮變多.經(jīng)過克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析,塔式蚯蚓生態(tài)濾池內(nèi)的微生物多為單細(xì)胞菌屬、假單細(xì)胞菌屬、革蘭氏陰性菌屬和不可培養(yǎng)桿菌屬,不同細(xì)菌條帶在不同級(jí)濾池內(nèi)差異變化明顯.

PCR-DGGE；蚯蚓生態(tài)濾池；微生物群落；指數(shù)；菌屬

塔式蚯蚓生態(tài)濾池是利用蚯蚓能夠提高土壤通氣性能和促進(jìn)有機(jī)物分解而設(shè)計(jì)的一種新型污水處理工藝,它充分利用了植物、動(dòng)物和微生物的協(xié)同作用,相比傳統(tǒng)污水處理工藝具有投資省、處理效率高、無污泥產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)[1].“蚯蚓”在該系統(tǒng)對污染物降解中的作用:一是去除污水中的有機(jī)物,二是提高土壤通氣性活化土壤,從而加大土壤富氧程度,間接促進(jìn)系統(tǒng)內(nèi)的耗氧微生物的活性.但是塔式蚯蚓濾池內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜,以往的研究主要集中在進(jìn)水、出水等外部影響因素上,沒有對塔式蚯蚓生態(tài)濾池內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)[1]進(jìn)行研究,使得對污水處理過程中微生物與處理效果關(guān)系性的研究仍處于“黑盒子”狀態(tài).

傳統(tǒng)的微生物生態(tài)學(xué)研究是基于微生物的直接培養(yǎng)來分析環(huán)境中微生物的種群結(jié)構(gòu)及其生態(tài)關(guān)系的,由于自然界中可培養(yǎng)微生物數(shù)量占實(shí)際微生物數(shù)量不足 10%,傳統(tǒng)方法顯然不適合微生物群體結(jié)構(gòu)研究.PCR-DGGE技術(shù)不經(jīng)過分離培養(yǎng)技術(shù)而直接對環(huán)境微生物進(jìn)行分析,克服了傳統(tǒng)微生物分類鑒定法的不足,可以直接可靠的反映出微生物的多樣性 .

本研究利用 PCR-DGGE技術(shù),以實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上運(yùn)行 1年的塔式蚯蚓生態(tài)濾池為研究對象,考察了三級(jí)塔式蚯蚓生態(tài)濾池中的微生物群落的演變.旨在為工藝運(yùn)行和濾池內(nèi)微生物的動(dòng)態(tài)變化之間架起一座溝通橋梁,根據(jù)測得的濾池內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)確定優(yōu)勢菌群進(jìn)而調(diào)節(jié)工藝參數(shù)提高污水處理效率.

1 材料與方法

1.1 塔式蚯蚓生態(tài)濾池

塔式蚯蚓生態(tài)濾池構(gòu)建于2009年2月中旬,共有三級(jí):一級(jí)、二級(jí)的尺寸(長×寬×高)0.5m×0.5m×0.6m,三級(jí)的尺寸 1.1m×0.65m×1.2m.每級(jí)濾池填料包括土壤、細(xì)砂、碎青石和鵝卵石,土壤表面均栽種吊鐘柳起到二次布水作用.實(shí)驗(yàn)使用的大平 2號(hào)蚯蚓屬于赤子愛勝蚯蚓,主要分布在土壤表層土和中層土中,蚯蚓在土壤中的接種密度為4.63g/L.進(jìn)水為南京大學(xué)學(xué)生宿舍化糞池出水,采用蠕動(dòng)泵控制進(jìn)行間歇進(jìn)水.水力負(fù)荷0.25m3/(m2?d),每天進(jìn)水6h進(jìn)水與落干的時(shí)間(即濕干比)為1:3.

生活污水首先進(jìn)入?yún)捬醭?經(jīng)過一段時(shí)間的厭氧硝化作用,部分污染物質(zhì)得到降解.厭氧池中的出水通過水泵的作用,分別進(jìn)入到一級(jí)濾池、二級(jí)濾池和三級(jí)濾池.污染物在多級(jí)濾料、蚯蚓和植物的共同作用下得到去除,三級(jí)濾池的出水達(dá)到國家污水排放的一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn).

圖1 塔式蚯蚓生態(tài)濾池的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure diagram of tower earthworm ecology-filter

1.2 樣品采集

分別于2009年11月和2010年6月從塔式蚯蚓生態(tài)濾池土壤層和砂石層取樣.其中一級(jí)、二級(jí)濾池取樣3份,分別是土壤表層土、中層土和砂石層,三級(jí)濾池取樣 6份分別是:土壤表層土、表層下5cm土、中層土、下層土、砂石層和青石層.所有樣品經(jīng)冷凍干燥儀-80℃凍干后,研磨后過 100目塞,樣品分裝放在-20℃保存待分析[3].

1.3 主要試劑

TE緩沖液、二溴乙錠染色劑、1×TAE均為自制,TaqDNA聚合酶和10×Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司,擴(kuò)增引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,超純水用Millipore公司的Simpicity型超純水機(jī)制成,瓊脂糖購自上海生工有限公司,dNTPs和PCR產(chǎn)物DNA Maker購自寶生物工程(大連)有限公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 基因組 DNA的提取, DNA的提取采用MOBIO公司的Ultra Clean Soil DNA isolation KIT試劑盒,包括 Bead Solution Tubes、2ml Collection Tubes、Spin Filter Units in 2ml Tubes、IRS solution、Solution S1、Solution S2、Solution S3、Solution S4、Solution S5[4].

1.4.2 巢式PCR擴(kuò)增,利用16SrDNA V3區(qū)引物對樣品DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,設(shè)計(jì)的引物為63F和1387R(一次PCR),338F-GC和518R(二次PCR).

一次PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min,然后94℃變性 45s,55℃退火 1min,72℃延伸 45s共 30個(gè)循環(huán),最后在72℃下延伸10min.二次PCR擴(kuò)增條件為 95℃預(yù)變性 10min,然后 95℃變性 1min,63℃退火2min,72℃延伸1min共30個(gè)循環(huán),最后在72℃下延伸10min.采用50μL的反應(yīng)體系,組成為:1μL的DNA模板,4μL的MgCl2,5μL的10×PCR buffer(Mg2+Free),4μL 的 dNTPs,1μL 每種引物,0.25μL的Taq酶,其余用無菌超純水補(bǔ)足至50μL.擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測[5].

1.4.3 PCR產(chǎn)物的DGGE分析,制備變性劑尿素濃度梯度 50%～80%,丙烯酰胺凝膠濃度為 10%的變性梯度凝膠電泳(DGGE),電泳電壓 100V,電泳時(shí)間 14h,二溴乙錠染色 15min,脫色 25min,圖像在觀測儀中拍照存檔[6].

1.4.4 Shannon-Wiener指數(shù)分析,應(yīng)用凝膠分析軟件Quantity One對掃描所得的DGGE圖譜進(jìn)行分析,并利用 Shannon多樣性指數(shù)來評價(jià)樣品的微生物多樣性.多樣性指數(shù)經(jīng)過長期試驗(yàn)和推導(dǎo),得出公式:

2．5 慢性病相關(guān)知識(shí)來源情況 被調(diào)查小學(xué)生最信任和最喜歡的健康知識(shí)來源分別是老師講課和電視，飲食和運(yùn)動(dòng)習(xí)慣受家人影響的比例最高。見表5。

式中: Pi=ni/N; ni為峰面積; N為所有峰的總面積.

2 結(jié)果

2.1 總細(xì)菌的DGGE圖譜

總細(xì)菌的DGGE圖譜如圖2所示總共12個(gè)樣品泳道,對2009年11月和2010年6月2次取樣樣品DGGE圖譜進(jìn)行了比較對比,圖2是圖譜效果較好的一組(2009年11月) .從右往左依次為一級(jí)濾池表層土B1、中層土B2、砂石B3,二級(jí)濾池表層土B4、中層土B5、砂石B6,三級(jí)濾池表層土B7、表層5cm下土B8、中層土B9、下層土B10、砂石B11和碎青石B12.12條樣品泳道均有豐富的條帶,且差異性顯著,其中既有一直保持?jǐn)?shù)量穩(wěn)定的優(yōu)勢菌種,又有經(jīng)過一、二級(jí)濾池逐漸培養(yǎng)起來的優(yōu)勢菌種,還有經(jīng)過多層濾池?cái)?shù)量變化較大的菌種.這說明不同濾池內(nèi)部細(xì)菌總?cè)簲?shù)量豐富,在處理生活污水的過程中優(yōu)勢菌種充分發(fā)揮了作用.

圖2 塔式蚯蚓生態(tài)濾池總細(xì)菌DGGE分離圖譜Fig.2 Diagram of DGGE pattern in tower earthworm ecology-filter

2.2 總細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)分析

蚯蚓生態(tài)濾池總細(xì)菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析見表 1,不同級(jí)濾池的生物多樣性差別比較大,這主要與樣品所處的濾池級(jí)數(shù)和在同一濾池中所處的位置有關(guān).

2.3 總細(xì)菌片段克隆測序分析和菌種測定

將總細(xì)菌DGGE中的部分優(yōu)勢條帶進(jìn)行割膠、克隆、測序分析,在Gen bank中進(jìn)行比對獲得各優(yōu)勢序列的同源性信息結(jié)果見表 2,細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3.

3 分析與討論

3.1 總細(xì)菌DGGE圖譜分析

3.1.1 從濾池角度分析 一級(jí)、二級(jí)濾池泳道內(nèi)細(xì)菌條帶強(qiáng)弱變化小,數(shù)量保持穩(wěn)定;三級(jí)濾池泳道內(nèi)細(xì)菌變化幅度大、條帶強(qiáng)弱差異顯著,其中砂石層、青石層泳道內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量和條帶亮度遠(yuǎn)優(yōu)于其他泳道.這主要是由于污水首先進(jìn)入一級(jí)和二級(jí)濾池,大部分污染物質(zhì)被去除.但前兩級(jí)濾池本身體積小,水力停留時(shí)間短,細(xì)菌代謝較快,差異性不是很明顯.三級(jí)濾池體積比較大,水力停留時(shí)間長,進(jìn)水中的污染物質(zhì)含量的減少直接影響了三級(jí)濾池表層土、中層土和下層土內(nèi)的細(xì)菌條帶較弱.

表1 總細(xì)菌Shannon-Wiener生物多樣性指數(shù)分析Table 1 Shannon-Wiener index of biodiversity on various bacteria

表2 微生物群落16SrDNA片斷測序分析結(jié)果Table 2 Result of sequence analysis from16SrDNA phrases in microbe community

圖3 塔式蚯蚓生態(tài)濾池總細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of various bacteria in tower earthworm ecology-filter

蚯蚓生態(tài)濾池對氨氮去除效果很好,氨氮得到了較好的吸附和硝化,但由于系統(tǒng)溶解氧較高,可利用的有機(jī)碳源較少,水流停留時(shí)間較短,反硝化受到抑制,硝態(tài)氮大量積累,總氮去除效果較差.為降低蚯蚓生態(tài)濾池出水中的總氮,必須強(qiáng)化濾池的反硝化功能,提高進(jìn)水C/N比,增加反硝化所需的有機(jī)碳源.在二級(jí)濾池出水中添加了葡萄糖碳源,加強(qiáng)了系統(tǒng)內(nèi)微生物的活性,促進(jìn)了反硝化作用[7],第三級(jí)濾池的砂石層和青石層細(xì)菌條帶數(shù)量多、亮度強(qiáng).不同濾池內(nèi)微生物的變化受濾池體積大小、污染物負(fù)荷多少和水力停留時(shí)間長短的影響.

3.1.2 從細(xì)菌條帶特征分析 12條泳道細(xì)菌條帶差異顯著,條帶b、e代表的菌種在一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)濾池內(nèi)一直存在,且數(shù)量變化小,強(qiáng)弱基本保持穩(wěn)定.說明這類菌種很好的適應(yīng)了濾池的環(huán)境,在濾池內(nèi)部生長適宜,對污水中的污染物去除作用突出,屬于優(yōu)勢菌種[8].條帶f、g、i代表的菌種也是一直存在,但是不同濾池該類菌種變化大,規(guī)律不是很明顯.說明該類菌種對污水的特定污染物質(zhì)作用突出,是污水處理中不可缺少的菌種,但不是優(yōu)勢菌種[9].條帶a、c、d、h代表的菌種剛開始并不存在后來才出現(xiàn),并且在三級(jí)濾池表現(xiàn)明顯.說明該類菌種在一級(jí)、二級(jí)濾池作用不明顯,到了三級(jí)濾池隨著環(huán)境的改變,外界條件適合該類菌種生存.該類菌種是三級(jí)濾池的特定菌種.條帶j所代表的菌種剛開始有,后來消失了.說明該類菌種適宜的外界條件發(fā)生變化,該類菌種從必需菌種發(fā)展到非必需菌種.

3.2 總細(xì)菌多樣性指數(shù)分析與討論

從表 1可以看出,總細(xì)菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)變化較大,這主要是由于濾池中濾料的變化、多級(jí)濾池大小的不同和污水水質(zhì)的變化造成的,細(xì)菌多樣性指數(shù)變化與理論基本符合.一級(jí)濾池 B1、B2、B3和二級(jí)濾池 B4、B5、B6樣品泳道細(xì)菌多樣性指數(shù)都有逐漸增大的趨勢,這主要是由于污水剛進(jìn)入濾池時(shí)對濾池內(nèi)的微生物產(chǎn)生產(chǎn)生一定沖擊,使得一些不適應(yīng)該污水的微生物生長處于劣勢,生物多樣性指數(shù)下降.一段時(shí)間后隨著細(xì)菌對污水的“適應(yīng)”,細(xì)菌種類和數(shù)量都增加,生物多樣性指數(shù)上升 .三級(jí)濾池B7、B8、B9、B10、B11、B12中細(xì)菌多樣性指數(shù)先減少后增加,這主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程中為了提高三級(jí)濾池的反硝化作用在二級(jí)出水中添加了碳源葡萄糖,充足的營養(yǎng)物為細(xì)菌生長提供了適宜的條件,隨著有機(jī)物的消耗細(xì)菌生長受到抑制,多樣性減少.而后,在三級(jí)濾池底部,添加的碳源加強(qiáng)了系統(tǒng)內(nèi)微生物的活性,促進(jìn)了反硝化作用[11].

3.3 總細(xì)菌片段克隆測序分析

根據(jù)表2的總細(xì)菌16SrDNA片斷測序分析結(jié)果可知,條帶d、e分別代表了假單胞菌和單胞菌.假單胞菌和單胞菌對有機(jī)物、氮、磷均有較強(qiáng)去除作用,同時(shí)假單胞菌還能通過反硝化作用強(qiáng)化氮的去除,條帶 d在三級(jí)濾池正因?yàn)榉聪趸饔貌疟憩F(xiàn)明顯,這與理論相符合[12].條帶f是黃桿菌,i是韋氏球菌均屬于是革蘭氏陰性菌,廣泛存在于污水、土壤中,對有機(jī)物、氨氮有一定的去除作用,正因?yàn)楦锾m氏陰性菌在砂石、青石中分布較少、且對磷、硝態(tài)氮的去除能力有限,才會(huì)出現(xiàn)變化幅度大、無規(guī)律的現(xiàn)象.條帶 g屬于芽苞桿菌,廣泛存在于自然界中屬于腐生或寄生菌類,是污水處理中不可缺少的菌屬.條帶a、c、h進(jìn)行對比分析,不能確定菌屬.但通過Gen bank對比分析可知,條帶 a的相似菌屬來源于活性污泥反應(yīng)器中的底泥,條帶 c的相似菌屬來源于固體顆粒表層,條帶 h的相似菌屬來源于生物濾料池中[13],與塔式蚯蚓生態(tài)濾池的菌屬來源環(huán)境基本吻合.

4 結(jié)論

4.1 塔式蚯蚓生態(tài)濾池中微生物群落的變化與濾池體積大小、水力停留時(shí)間和污染物負(fù)荷等因素有關(guān),不同級(jí)的濾池和同級(jí)不同濾料層內(nèi)的微生物多樣性變化差異較大,一級(jí)和二級(jí)濾池生物多樣性從上至下逐漸增多,三級(jí)濾池微生物多樣性先減少后增多.

4.2 塔式蚯蚓生態(tài)濾池中細(xì)菌條帶差異顯著,一、二、三級(jí)濾池內(nèi)既有一直保持穩(wěn)定變化不大的細(xì)菌條帶b、e,又有后來逐漸增加增強(qiáng)的細(xì)菌條帶 a、c、d、h,還有系統(tǒng)運(yùn)行過程中消失的細(xì)菌條帶 j.二級(jí)濾池出水中葡萄糖的添加,加強(qiáng)了系統(tǒng)內(nèi)微生物的活性,細(xì)菌條帶普遍變多變亮.

4.3 細(xì)菌片段克隆測序發(fā)現(xiàn),塔式蚯蚓生態(tài)濾池內(nèi)的細(xì)菌多為單細(xì)胞菌屬、假單細(xì)胞菌屬、革蘭氏陰性菌屬和不可培養(yǎng)桿菌等,它們對污水中污染物質(zhì)的去除發(fā)揮了重要作用.

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致謝：在試驗(yàn)和論文撰寫過程得到唐開平女士的支持,在此表示感謝.

Research on microbe community in tower earthworm ecology-filter by PCR-DGGE.

GUO Fei-hong1, ZHENG Zheng2*, ZHANG Ji-biao2(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment,Nanjing University, Nanjing 210093, China；2.Department of Environmental Science and Engineering, Fudan University,Shanghai 200433, China). China Environmental Science, 2011,31(4)：597～602

Change of microbe community in tower earthworm ecology-filter was studied in this research with PCR-DGGE technology (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis). These results showed that: the change of microbe community was obvious and linked with hydraulic resident time、pollutation burden and the volume of filters.Meanwhile, Shannon-Wiener Index of biodiversity increased from 0.25 to 1.27 in an all-round way, including 0.29～1.05 in the first filter, 0.75～0.97 in the second filter and 0.87～0.25～1.27 caused by some glucose added into influent in the last filter. Under the same reason, the activity and light of denitrifying bacteria were intensified on bluestone and gravel layers.After analysis of cloning sequencing and phylogenetic tree, most of the inferred bacteria were Sphingomonas,Pseudomonas, Gram-negative bacteria and uncultured Bacillus and changed evidently in different filters.

PCR-DGGE；earthworm ecology-filter；microbe community；index；bacteria

X705

A

1000-6923(2011)04-0597-06

2010-07-10

國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2008ZX07101-004)

* 責(zé)任作者, 教授, zzhenghj@fudan.edu.cn

郭飛宏(1986-),男,山東濟(jì)寧人,碩士研究生,主要從事流域面源水污染控制研究.發(fā)表論文4篇.