1株α-蒎烯降解菌的分離鑒定及降解特性研究

成卓韋,顧信娜,蔣軼鋒*陳建孟,陳 浚(.浙江工業大學生物與環境工程學院,浙江 杭州 30032；2.浙江工業大學環境工程研究中心,浙江 杭州 30032)

1株α-蒎烯降解菌的分離鑒定及降解特性研究

成卓韋1,顧信娜1,蔣軼鋒1*陳建孟2**,陳 浚1(1.浙江工業大學生物與環境工程學院,浙江 杭州 310032；2.浙江工業大學環境工程研究中心,浙江 杭州 310032)

從處理廢氣的生物濾塔內篩選到1株能高效降解α-蒎烯的菌株PT.通過菌落形態、生理生化特征、16SrRNA基因序列相似性分析及Biolog鑒定等方法,確定該菌株屬于熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens).菌株PT最佳生長條件為: NaCl濃度0.00%、pH7.13、溫度25.5℃,降解速率達到最大值5.22mg/(L?h).降解過程符合Haldane’s抑制生長動力學模型,最大比降解速率為0.0364h-1.菌株PT能不同程度地降解一些分子結構較為簡單或與α-蒎烯結構相似的工業有機污染物.代謝產物分析表明,菌株PT在降解α-蒎烯的過程中產生檸檬油精紫蘇酸等結構較為簡單的物質,它們最終被完全礦化為CO2或合成細胞自身組成物質.碳平衡分析表明,底物有機碳含量完全礦化和轉化為細胞生物量的比例分別為64.83%和30.37%.

α-蒎烯；生物降解；動力學；礦化率；代謝途徑

萜類化合物作為重要的化工中間體,廣泛用于木材加工、香料制造、制藥等行業.具有環烯烴結構的α-蒎烯(C10H16)是單萜類物質的典型代表.α-蒎烯進入大氣后,直接危害人類健康,并與大氣中的臭氧、羥基等自由基發生反應,形成光化學煙霧,破壞臭氧層[1-3].目前,已報道的降解 α-蒎烯的微生物主要有假單胞菌(Pseudomonas)[4],白色芽孢桿菌(Bacillus pallidus)[5],曲霉菌(Aspergillus)[6],諾卡氏菌(Nocardia)[7]等.

研究降解菌株特性,對于利用微生物降解工業有機污染物具有理論意義,同時,對于快速實現生物濾塔的掛膜啟動也具有指導作用.課題組在前期處理α-蒎烯的生物濾塔[8]中,成功選育到1株能高效降解 α-蒎烯的菌株,鑒定為 Pseudomonas fluorescens.本實驗采用響應面法,優化菌株生長條件,對其降解特性和動力學行為進行分析,并初步探討可能的降解途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物膜 從穩定運行的生物濾塔內取1.5g生物填料于30mL無菌水中,振蕩離心后,將生物樣品懸浮于 0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 7.2)中,備用.

1.1.2 培養基 無機鹽培養基(MM)(g/L):K2HPO4·3H2O 0.6g,KH2PO40.15g,NaNO32.25g,NH4Cl 2.86g,MgCl20.06g,CaCl20.006,FeSO4·7H2O 0.003g;微量母液 5mL(ZnCl288mg/L,MnCl260mg/L,KI 10mg/L,Na2MoO4100mg/L,H3BO450mg/L),pH值為7.0～7.2;110℃滅菌40min.添加一定濃度的α-蒎烯作為唯一碳源.

無機鹽篩選固體培養基:MM 培養基添加1.8%～2%的固體瓊脂,121℃滅菌 20min.滴加一定量的α-蒎烯于棉團上用以釋放氣態碳源.

LB斜面保存培養基:胰蛋白胨 10g,酵母粉5g,NaCl 5g,蒸餾水1L,瓊脂18g,pH值為7.0～7.2;121℃滅菌20min.

1.2 菌株分離純化

取0.5mL生物膜樣品,用無菌水進行梯度稀釋,涂布于無機鹽篩選固體培養基上,每個梯度做3個平行樣,30℃培養.4～5d后,挑取平板上的單菌落,接入 MM 液體培養基中,以 α-蒎烯為唯一碳源,置于160r/min 搖床振蕩培養,將具有 α-蒎烯降解能力的菌株進行分離純化,最后 4℃斜面保藏.

1.3 菌株鑒定

菌株的生理生化實驗方法參考《常見細菌系統鑒定手冊》[9].Biolog實驗方法參考文獻[10],采用GN2碳源板鑒定.

采用3S柱離心式環境樣品DNA回收試劑盒(V2.2,上海申能博彩生物科技有限公司),提取菌株的 DNA.選用細菌通用引物 BSF8/20和BSR1541/20(寶生物工程(大連)有限公司),序列分別為5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'和5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'.PCR擴增后產物由上海英濰捷基生物技術有限公司測序,然后將測序結果同GenBank中的基因序列進行同源性比較分析,選取 1.5kb左右長度進行比對,采用鄰位連接法進行系統發育分析,大致確定菌株種屬情況.

1.4 環境因素對菌株降解效率的影響

運用響應面法考察了溫度、pH值和培養基鹽度 3個環境因素對菌株降解效率的影響, 參數設計見表 1.將處于對數生長期的菌株離心洗滌,徹底去除殘留的α-蒎烯后,懸浮于0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中.于 200mg/L α-蒎烯的 MM 培養液中加入上述菌懸液(生物量達到9.96mg/L),同時以不加菌懸液作為空白對照,密封后置于相應條件下培養,定時測定液相中殘留的 α-蒎烯和生物量.根據測得的降解速率,利用SAS system軟件(SAS,7.0 Version)對其進行二次多元回歸,令回歸方程一階偏導數為零,得到響應值最大時所對應的各因素組合,即為菌株最佳降解條件.

表1 Box-Behnken 實驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experimental design

1.5 多種碳源降解能力測定

從固體培養基斜面上挑取1～2環到含α-蒎烯200mg/L的MM液體培養液中,30℃、160r/min搖床培養.菌株活化后轉接到新鮮MM培養基中,繼續以α-蒎烯為唯一碳源培養,待菌株進入對數生長期后,9000r/min離心10min,用無菌水重復洗滌 3次,徹底去除殘留的 α-蒎烯后,懸浮于0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中.于 50mL MM 培養液中加入上述菌懸液(生物量達到9.96mg/L),分別以苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、石油醚、環己烷、正己烯環己烯、十四烷、甲基乙基酮等工業中常見的污染物作為碳源,濃度均控制為 200mg/L,密封后振蕩培養(160r/min,30).℃同時以不加菌液、含有200mg/L上述碳源的MM培養基為空白對照,定時測定降解率和生物量.

1.6 菌株降解動力學研究

取處于對數生長期的菌懸液,于9000r/min、離心10min,用無菌水重復洗滌3次,徹底去除殘留的 α-蒎烯后懸浮于 0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中.于50mL MM培養液中加入上述菌懸液(生物量達到 10.28mg/L)后,分別加入 α-蒎烯,使其濃度達到 50,100,200,400,800,1000,1500和2000mg/L,密封后振蕩培養(160r/min,30).℃同時以不加菌液的MM培養基為空白對照,定時測定降解率和生物量.

1.7 礦化率測定與代謝途徑初探

取處于對數生長期的菌懸液9000r/min離心10min,用無菌水重復洗滌 3次,徹底去除殘留的α-蒎烯后懸浮于 0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中.于 0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.2)中加入上述菌懸液(生物量達到10.54mg/L)后,分別加入 α-蒎烯,使其濃度達到 50和 200mg/L,密封后振蕩培養(160r/min,30).℃同時以不加菌液的磷酸緩沖溶液為空白對照,定時測定密封瓶上方氣相中的CO2和α-蒎烯濃度,液相中α-蒎烯濃度和相應的TOC以及生物量.

1.8 分析方法

1.8.1 α-蒎烯分析 采用氣相色譜(Agilent 6890)對搖瓶上方 α-蒎烯氣體進行定量分析.色譜柱為HP-Innowax 型毛細管柱(30m×0.32mm× 0.5μm),進樣口和檢測器(FID)的溫度分別為 250℃和300,℃柱溫為140,℃柱流速1mL/min,進樣體積800μL.液相中 α-蒎烯經正己烷萃取后亦采用氣相色譜進行定量分析.采用程序升溫: 40℃維持1min,20/min℃升溫至120,℃ 60/min℃升溫至180℃維持2min.柱流速1mL/min,進樣體積1.0μL.

1.8.2 其他有機物分析 BTEX、環己烷、正己烯、環己烯、十四烷等萃取后同樣采用氣相色譜定量測定:色譜柱為 HP-Innowax型毛細管柱(30m×0.32mm×0.5μm).進樣口和檢測器(FID)的溫度分別為210℃和200,℃柱溫為90,℃柱流速1mL/min,進樣量 1.0μL.甲基乙基酮采用氣相色譜直接測定:色譜柱為 HP-Innowax型毛細管柱(30m×0.32mm×0.5μm).進樣口和檢測器(FID)溫度分別為200℃和260,℃柱溫為90,℃柱流速1mL/min,進樣量 1.0μL.

1.8.3 生物量測定 使用 722型可見分光光度計測定吸光度值,再根據標準曲線換算得出菌株濃度(以mg/L記).

1.8.4 代謝產物分析 CO2濃度分析采用鹽酸驅趕法使液相中的 CO2溢出進入密封瓶上方的氣相中,用裝有熱導檢測器(TCD)的氣相色譜(Agilent 6890)進行定量分析,色譜柱為HP-Plot-Q 型毛細管柱(30m×0.32mm×20μm),分析條件為柱溫40,℃進樣口溫度90,℃檢測器溫度100.℃TOC分析:TOC測定采用總有機碳測定儀(TOCVCPH, Shimadzu).代謝有機產物分析:代謝產物經衍生化后采用氣相色譜-質譜聯用(Agilent 7890N/MS 5975)進行分析.色譜柱為HP-5MS型毛細管柱,程序升溫:100℃保留1min,5/min ℃升高到 280℃并保留 10min,載氣為氦氣,柱流速1mL/min.質譜條件:EI 源,電離能量70eV,離子源250,℃輔助溫度280,℃倍增電壓1000V,掃描質量數 50～650amu.

2 結果與討論

2.1 菌株鑒定

2.1.1 基本生理生化試驗結果 通過初篩與復篩,選育到1株能高效降解α-蒎烯的菌株,編號為PT.該降解菌在MM瓊脂平板上30℃培養72h后,形成表面光滑透明的菌落.菌株 PT為革蘭氏陰性,成對聚集出現,無鞭毛,無莢膜,無芽孢.相應的生理生化試驗結果為:過氧化氫酶試驗、吲哚試驗、V.P.試驗、氧化酶試驗、明膠液化實驗、甲基紅試驗、硝酸鹽試驗等均為陽性;淀粉水解試驗為陰性;菌株能利用葡萄糖但不能利用乳糖.

2.1.2 菌株PT的16S rRNA基因序列分析與系統發育 菌株PT的16S rRNA基因經PCR擴增和測序后(GenBank登錄號為 FJ169494),同GenBank中的基因序列進行同源性比對,再通過系統發育樹的建立從而確定其在系統發育學上的地位.比對后,發現該菌株屬于 Pseudomonas屬,且同 Pseudomonas fluorescens相似性高達99%.菌株 PT與 Pseudomonas sp.中其他相近的模式株比對結果見圖 1(其中 Nocardia sp.和Geobacillus pallidus DSM 為文獻報道能降解α-蒎烯的菌株).結合菌株生理生化實驗與 16S rRNA基因序列系統學的分析結果,菌株PT可鑒定為P. fluorescens.菌株PT于2008年10月27日保藏在中國典型培養物保藏中心,編號為CCTCC M 208182.

圖1 菌株PT與Pseudomonas sp.中典型菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the strain PT with type strains of Pseudomonas sp.

2.1.3 菌株 Biolog 鑒定 采用 GN2平板分析菌株對 95種碳源的代謝能力,將結果與 Biolog系統數據庫MicroLog software (Release Version 4.20.04)進行比對,進一步確定其種屬特征,從而提高菌株鑒定的可靠性.培養6h后,菌株PT與P.fluorescens(熒光假單胞菌)相似度高達 0.805(臨界值為0.75)[11],為良好匹配.因此,結合16S rRNA基因序列分析,可以確定菌株 PT屬于 P.fluorescens.

2.2 環境因素對菌株降解效率的影響

以測試時間內平均降解速率為目標響應值,各因素試驗結果和模型預測值如表 2所示.利用SAS system軟件對實驗數據進行多元回歸,得到回歸方程:

式中: Y為α-蒎烯的降解速率[mg/(L?h)], X1, X2,X3分別為NaCl、pH值和溫度的Code值.多元回歸方程的相關系數 R2=0.9581,說明該模型所預測的降解速率與實際降解速率具有很好的相關性.對上述多元回歸方程作二元響應曲面,從而得到各個環境因素對降解速率的直觀影響圖(圖2).

表2 設計實驗響應值及預測值Table 2 The actual and predicted degradation rate by RSM

從圖2中可以看出,培養基pH值和培養溫度對菌株的降解活性有很大的影響.當 pH7、培養溫度25～30℃時,降解活性達到最大值;pH值為酸性或堿性,抑或培養溫度較高或較低時,菌株的降解活性均有不同程度地下降.由于一般石油廢水等工業污水中均含有一定的鹽度,因此在本試驗中選擇了鹽濃度作為一個考察因素.鹽濃度不僅對于細胞的滲透壓具有一定的影響,而且還可影響細胞中脫氫酶和氧化酶的分泌 ,進而影響細胞降解底物的能力.Diaz等[13]和Nicholson等[14]通過研究發現,一些以碳氫化合物為生長碳源的微生物由于自身具有相應的耐鹽酶系,從而能適應一定的鹽度環境.但在本試驗中,當外界環境鹽度為0%時,菌株利用底物的情況良好,隨著NaCl濃度的增加降解活性逐漸受到了抑制,表明菌株PT無法在一定的鹽度環境中生長.

圖2 環境因素對菌株降解速率的三維響應面圖Fig.2 Three-dimensional surfaces of the environmental factors on the degradation rate

對回歸的二次多項式模型方程求一階偏導,并令其等于零,可以求得最佳的環境因子,即當NaCl濃度、pH值、溫度分別為0.00%、7.13和25.5℃時,菌株 PT對于 α-蒎烯的降解速率達到最大值,為 5.35mg/(L?h).為了驗證模型的準確性,在鹽度 0.00%、pH7.10、溫度 26℃時進行了 3次搖瓶試驗,測定菌株 PT的平均降解速率分別為 5.21,5.18和 5.27mg/(L?h),均與預測值較為接近,可見所擬合的多元回歸方程能較準確地預測不同環境因子條件下菌株對于 α-蒎烯的平均降解速率.

2.3 菌株降解底物譜研究

在實際應用中,常常是多種有機污染物共存,因此考察菌株PT對各種常見污染物的降解能力就顯得尤為重要.菌株PT對BTEX、石油醚、C6的同分異構體及其他碳氫化合物等直接代謝的情況見表 3.菌株 PT幾乎可以不同程度地降解苯、甲苯、乙苯等 BTEX,以及石油醚、環己烯等碳氫化合物,但不能代謝環己烷和正己烯.

表3 菌株PT對不同碳源的降解率與生物量Table 3 Biodegradation rates and biomass of different carbon source utilized by the strain PT

通常有機污染物的分子結構、提供或接受電子的能力決定其化學穩定性,影響微生物細胞對有機物的吸附、轉移等能力,進而決定有機物的可生物降解性[15].對于與母體化合物或代謝中間產物結構相似的物質,菌體一般都能不同程度地降解.α-蒎烯降解過程中可能產生檸檬油精(limonene)、對甲基異丙基苯(P-cymene)等中間代謝產物[16],這些物質的分子中都含有類似苯環的結構,菌株具有的相關酶系能夠有效地催化降解這種結構.由于BTEX的分子中都含有苯環,因此菌株 PT能夠不同程度地降解這些物質,特別是對二甲苯,其結構與對甲基異丙基苯非常相似,在6種苯系物中相同時間內被代謝的程度是最高的.環己烯與檸檬油精都具有六元環結構,并且環內含有C=C雙鍵,菌株PT對其的去除率達到了72.83%.而對于環己烷和正己烯,其結構與 α-蒎烯或可能的代謝產物迥異,因此菌株無法利用這些物質.一般認為,直鏈烷烴由于具有較小的空間位阻,可降解性大于相應的支鏈烷烴[17-18].雖然石油醚(主要成分是戊烷和己烷)、十四烷,甲基乙基酮等化合物的結構與α-蒎烯的差別較大,但這些物質結構較簡單,或是直鏈烷烴,或是 C原子較少,因而菌株表現出了較強的利用能力.以上的實驗結果和相應分析表明,菌株 PT能降解一些常見的工業有機廢氣組分,對于降解底物具有一定的廣譜性.

2.4 降解動力學研究

高濃度的有機污染物可能會對菌株產生一定的毒害作用,使其代謝過程變得緩慢甚至停滯.對不同初始濃度的底物降解過程考察發現(圖3),菌株PT的降解速率在一定濃度范圍內隨著底物濃度的增加而增加,當濃度超過200mg/L時,抑制作用開始發生,平均降解速率開始緩慢下降.Haldane’s抑制生長動力學模型能較準確地定量描述這種抑制作用[19],其表達式為:

式中: μ為菌株比降解速率, h-1; X為菌濃度,mg/L;t為時間, h; S為底物濃度, mg/L; Ks為半飽和系數, mg/L; KI為抑制系數, mg/L; μmax為最大比降解速率, h-1.

圖3 菌株降解α-蒎烯比降解動力學曲線Fig.3 Specific degradation kinetics curve for the strain PT degrading α-pinene

降解動力學擬合結果如圖 3所示.擬合所得曲線與實驗數據符合程度較好,相關系數達到了0.9174.當底物濃度為222mg/L時,比降解速率達到最大值0.0364h-1,相應的半飽和系數Ks及抑制系數 KI分別為 163.83mg/L和 317.62mg/L.Yoo等計算了假單胞菌Pseudomonas sp.strain PIN對于 α-蒎烯的比降解速率,其值約為 0.0102h-1,略低于本實驗分離得到的菌株,表明 P. fluorescens PT 具有較好的降解α-蒎烯的能力.

2.5 代謝途徑初探

圖4 菌株降解過程中α-蒎烯濃度、TOC、生物量等參數的變化曲線Fig.4 Variation in the concentration of α-pinene, TOC value, biomass and the mineralization rates during the biodegradation process

2.5.1 降解過程中不同C形式的分析 通常,烷烴類化合物在生物降解過程中能夠被轉化為醛酮、羧酸等羰基類化合物,進而被礦化為 CO2或是組成自身物質.菌株PT在降解100mg/L的α-蒎烯過程中,底物濃度、生物量積累、TOC生成等參數隨時間的變化如圖 4所示.隨著底物逐漸被降解,培養液中 TOC的含量呈上升的趨勢,表明疏水性的 α-蒎烯轉化形成了水溶性的中間產物.通過對培養液的 pH值進行監測,發現有下降的趨勢,表明水溶性的產物中有小分子有機酸成分.這與一些研究結果相類似,即 α-蒎烯的可能降解產物為紫蘇酸(perillic acid)、對異丙基苯甲酸(cumic acid)等有機酸類物質,它們的積累會使培養液呈弱酸性[16].培養液中水溶性物質的含量在α-蒎烯幾乎消耗盡35h后才達到最大值,這種滯后現象說明降解過程中產生了一種疏水性的物質,這種物質只有在α-蒎烯較低時才能被菌株代謝.培養液的TOC值隨著生物量的增大而逐漸減小,表明 PT能夠利用這些代謝產物,并最終達到礦化底物的效果而不僅僅是轉化[20].經過相應的計算,在140h時,培養液中碳含量、菌體中增值的碳含量(干重 26g的生物質大約含 1mol的碳) 、CO2中的碳含量分別為0.1779,2.6728和5.705mg,接近于消耗的總碳量(8.8mg),礦化率約為64.83%.Rittman等[22]研究發現,有機化合物的生物降解過程通常包括物質礦化和細胞物質合成兩個方面,并指出生物量的表達式可用C5H7NO2表示,因此,通過化學計量法計算,菌株PT降解α-蒎烯的過程可表示為:

2.5.2 代謝途徑初探 靜息細胞法(resting cells是利用微生物細胞懸浮在只含有底物的去離子水或緩沖溶液中進行生化反應觀察其產物的研究方法,其優點是通過有效地控制培養基的成分,使某些產物得到大量積累,從而可以分析微生物代謝的過程[23].采用靜息細胞降解 α-蒎烯,利用衍生-GC/MS、離子色譜等分析方法對菌株降解過程的中間產物進行定性分析,相應的 GC/MS譜圖和離子色譜圖如圖5所示.在2.3.1中曾提及,在菌株的降解過程中可能產生了不溶于水的物質,從而致使TOC滯后現象出現.通過GC/MS定性,發現此類物質是檸檬油精(limone),這在已有的報道中也有發現.菌株 PT對檸檬油精的直接代謝和共代謝實驗表明, PT可以利用檸檬油精作為碳源生長,但當 α-蒎烯與其共存時,只有當α-蒎烯濃度較低時,培養液中的檸檬油精才能被菌株利用.Yoo等[4,16]采用Pseudomonas sp. strain PIN 轉化 α-蒎烯時,發現只有當 α-蒎烯濃度較低時,中間產物檸檬油精才能被代謝而濃度逐漸降低,同時以α-蒎烯為唯一碳源培養的菌株不能立即代謝檸檬油精,必須經歷較長的適應期后才能利用檸檬油精作為生長碳源.

根據檢測到的代謝產物并結合相關文獻報道,推測菌株PT對α-蒎烯的可能的代謝途徑如下(圖6):菌株含有的降解酶先攻擊分子結構中的四元環,開環后形成檸檬油精(D1).檸檬油精是一種不溶于水的物質,其結構中的甲基很容易被相應的降解酶攻擊,經歷一系列的氧化過程,形成相應的有機酸—紫蘇酸(D2),從而驗證了培養液的 TOC增大和pH 值下降的現象.隨后,氧分子在降解酶的催化下繼續攻擊六元環中的雙鍵,經去碳酸基和羥基化作用,六元環開環后形成二羥基化合物(D3)和直鏈烯烴,這些物質極不穩定,最終會被氧化為甲酸(D4)、乙酸(D5)和丙酮酸(D6),進入TCA循環后或被礦化為CO2,或被合成自身細胞物質.

圖5 菌株降解α-蒎烯中間產物分析結果Fig.5 Analytical results of α-pinene metabolites produced by the strain PT

圖6 菌株降解α-蒎烯可能代謝途徑Fig.6 Proposed degradation pathway for the degradation of α-pinene by the strain PT

3 結論

3.1 選育到1株能高效降解α-蒎烯菌株PT,基于菌株形態、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析和 Biolog鑒定,可確定菌株 PT為Pseudomonas sp.(熒光假單胞菌).通過響應面分析得出菌株最佳生長條件:NaCl濃度、pH、溫度分別為 0.00%、7.13和 25.5℃時,降解速率達到最大值,為 5.22mg/(L?h).

3.2 菌株PT能不同程度利用BTEX、石油醚、環己烷等工業常見的有機污染物,其降解α-蒎烯過程符合 Haldane’s抑制生長動力學模型.當 α-蒎烯濃度為222mg/L時,比降解速率達到最大值0.0364h-1,相應的半飽和系數Ks及抑制系數KI分別為163.83mg/L和317.62mg/L.

3.3 在生物降解過程中,菌株PT首先把α-蒎烯降解為檸檬油精,然后經歷氧化、開環等過程,形成紫蘇酸、2,3-二羥基丁二烯等物質,最終被氧化為甲酸、乙酸等小分子酸,進入 TCA 循環,形成CO2、H2O和自身組成物質.

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Isolation and identification of an alpha-pinene-degrading bacterium and its degradation characteristics

CHENG Zhuo-wei1, GU Xin-na1, JIANG Yi-feng1*, CHEN Jian-meng2**, CHEN Jun1(1.College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China；2.Research Center of Environmental Engineering Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China). China Environmental Science, 2011,31(4)：622～630

An aerobic bacterium (strain PT) capable of degrading α-pinene was isolated from the biofilm of a biotrickling filter. Based on its morphology, physiological-biochemical characteristics, 16S rRNA gene sequence analysis and Biolog analysis, the strain PT was identified as Pseudomonas fluorescens. The results of response surface methodology (RSM)indicated that the initial conditions of NaCl concentration 0.00%, pH7.31 and temperature 25.5°C were optimal for its growth with the maximum biodegradation rate. Haldane’s kinetics model could be fit to the kinetics date well and the maximum specific degradation rate was 0.0364h-1. The strain PT could biodegrade several industrial contaminants which were characterized with simple or similar structures to that of α-pinene. GC/MS analysis showed that α-pinene was converted to some simple organic compounds (limonene, perillic acid etc.) by the strain PT, which was finally mineralized to CO2, H2O and synthesized to cell biomass. Analysis of carbon balance indicated that the rates for the mineralization and the biomass synthesis were about 64.83% and 30.37%, respectively.

α-pinene；biodegradation；kinetics analysis；mineralization rate；metabolic pathway

X172

A

1000-6923(2011)04-0622-09

2010-08-31

國家科技支撐計劃 (2007BAE58B07);浙江省重點創新團隊項目(R5090230);浙江省自然科學基金 (Y5080142)

* 責任作者, 副教授, jyf@zjut.edu.cn

** 責任作者, 教授, jchen@zjut.edu.cn

成卓韋(1982-),男,浙江杭州人,浙江工業大學生物與環境工程學院博士研究生,主要從事大氣污染控制技術和典型污染物生物降解技術研究.發表論文10余篇.