三甲基氯化錫對水生生物的毒性效應

李志斐,謝 駿,龔望寶,余德光,王廣軍,唐小江(.中國水產科學研究院珠江水產研究所,廣州 廣東5080；2.上海海洋大學水產與生命學院,上海 2006；.廣東省職業病防治院,廣州 廣東 5000)

三甲基氯化錫對水生生物的毒性效應

李志斐1,2,謝 駿1*,龔望寶1,余德光1,王廣軍1,唐小江3(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所,廣州 廣東510380；2.上海海洋大學水產與生命學院,上海 201306；3.廣東省職業病防治院,廣州 廣東 510300)

研究了三甲基氯化錫(TMT)對蛋白核小球藻、大型溞和斑馬魚的急性毒性影響.結果表明,TMT在實驗濃度下,對蛋白核小球藻的生長有抑制作用,濃度越高抑制作用越明顯.較高濃度組(5.31,20mg/L)可致死部分蛋白核小球藻細胞,TMT對蛋白核小球藻的 96h-EC50為0.46mg/L,屬于極高毒物質;TMT對大型溞的 48h-LC50為 0.087mg/L,也屬于極高毒性;TMT對斑馬魚的 96h-LC50為 2.45mg/L,屬于高毒性.TMT對這3種水生生物的抑制率/致死率(EC50/LC50)隨時間呈規律性變化.TMT的神經毒性和親脂特性可能是其對水生生物較高毒性的主要原因.

TMT；毒性；蛋白核小球藻；大型溞；斑馬魚

三甲基氯化錫(TMT)是一種重要的有機錫化合物,廣泛用于工業塑料熱穩定劑中.隨著塑料工業及二手塑料再加工的迅速發展,TMT會隨生產廢水、地表徑流等途徑進入水環境中,TMT也曾用于化學消毒劑和殺菌滅蟲劑,且 TMT在塑料中的濃度高達8.5～24.9mg/kg[1].TMT具有很好的親水性和親脂性[2-3],極易通過消化和皮膚黏膜進入機體,對水生生物產生毒性并在體內富集[4-6].在海洋、江河、水庫、地下水、水生生物機體內等均發現 TMT的存在[7-9],因此極有可能對水生生物造成潛在危害.

目前國內外關于TMT對水生生物的毒性效應研究多集中在TMT的神經效應及生物累積性等方面,如Wang等[10]就TMT對褐菖鮋(Sebastiscus marmoratus)腦神經效應進行了報道,Hadjispyrou等[5]就鹵蟲對TMT的富集進行了報道.而對其進入水環境后對整個水生態系統的風險性評價并不多,因此本研究以水生生物中 3大營養級上的代表生物(蛋白核小球藻(Chlorelapyrenoidosa)、大型溞(Daphnia magna)和斑馬魚(Danio rerio))為實驗材料,研究了TMT對三種不同水生生物的急性毒性,旨在判斷其對水生生物可能造成的危害,為有關水生態風險評價提供參考依據,并為相關水質標準的建立提供基礎資料.

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白核小球藻購于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫, BG11培養;大型溞取自河北大學生物修復技術研究實驗室,參照大型溞測試標準方法[11]進行飼養,經實驗室馴化培養后使其保持在孤雌生殖狀態;斑馬魚(AB系)來自廣州市花地灣市場,為當年生、同一批次斑馬魚,平均體長(2.4±0.2)cm,馴養2周以上,自然死亡率＜1%.

三甲基氯化錫購自美國Acres organics公司,常溫下為白色結晶狀物質,純度＞99%.

1.2 藻類生長抑制試驗

參照文獻[12]進行.根據預試驗結果,確定TMT的濃度范圍為 0.1～20mg/L,按等對數間距設置5個試驗濃度和1個對照組,每次試驗設3個平行樣.在500mL三角瓶中加入20mL藻(處于對數同步生長期)試驗液,分別添加30mL不同濃度TMT溶液,溶液終體積 200mL,混合溶液蛋白核小球藻的初始接種密度為5×105個/mL.培養條件: pH7.6,溫度(24±1),℃光強為4000lx,光暗比為l4h∶10h,每天定期搖動藻液 3 次,每次 10min.所用玻璃器皿和培養液均經過 121℃、25min滅菌.實驗進行到0,24,48,72,96h定時取樣用血球計數板計數細胞密度,每次取樣相對偏差＜10%.

[13]以對照組的平均值作對照,求各個濃度組的抑制率,采用機率單位法計算各時間的 EC50及相關方程.EC50值計算步驟為,先通過查表,將蛋白核小球藻的抑制速率換算成概率單位,然后將 TMT濃度對數與概率單位進行一元線性回歸,得到TMT對小球藻的劑量-反應方程,當概率單位為 5時,通過回歸方程計算EC50值.

1.3 大型溞活動抑制試驗

參照大型溞測試標準方法[11]進行.大型溞為本實驗連續培養 3代以上的單克隆品系.根據預備試驗結果,確定 TMT的濃度范圍為 0.05～0.50mg/L,按等對數間距設置11個TMT的試驗濃度和一個對照組,每次試驗設4個平行樣,結果取4組平均值.在100mL燒杯內加入50mL設定濃度的 TMT溶液和 10只(溞齡＜24h)幼溞,用保鮮膜封口以減少蒸發.試驗水溫為(23±1),℃pH7.6,24h光照黑暗循環,光照強度 2000lx,靜置培養.分別在24,48h觀察記錄大型溞的中毒及死亡狀況.轉動試驗燒杯,15s內活動距離不超過本身的長度,即認為大型溞活動受到抑制,即使觸角仍在擺動的大型溞,也認為是受抑制的個體.大型溞的死亡以其心臟停止跳動為標志[13].采用機率單位法計算各時間的半數致死濃度(LC50)和半效應濃度(EC50)及相關方程[13].

1.4 斑馬魚急性毒性試驗

參照標準方法[14]進行.在預實驗的基礎上得出的濃度范圍 1.6～10mg/L.設置 17個濃度梯度,同時以空白為對照,均設4個平行.結果取4組平均值.在每一試驗濃度組和對照試驗組容器隨機放入10尾斑馬魚.每24h更換試驗液1/2,試驗水溫為(23±1)℃,pH7.6,自然光照,靜置培養,試驗期間不投放餌料.于 24,48,72,96h觀察記錄斑馬魚的中毒及死亡情況,以沒有肉眼可見的活動、鰓的翕動停止及觸碰尾部無反應為斑馬魚死亡標準,采用機率單位法[13]計算各時間的LC50及相關方程.

2 結果與分析

2.1 TMT對蛋白核小球藻的生長抑制效應

從蛋白核小球藻 96h生長試驗結果可看出(圖1),蛋白核小球藻在TMT中生長受到一定的抑制,并呈現明顯的劑量-效應相關關系.在整個生長試驗過程中,0.1,0.38和1.41mg/L處理下蛋白核小球藻生長受到抑制,生長緩慢,5.31mg/L處理為零增長;20mg/L處理則表現為很強的抑制作用,蛋白核小球藻長勢從試驗開始就下降直至實驗液逐漸透明.顯微鏡觀察到藻體開始分解,大量藻細胞死亡.直到實驗結束 96h時,0.1,0.38,1.41,5.31和20mg/L濃度組與96h對照組相比抑制率分別為34%,48%,58%,77%和92%.

圖1 TMT對蛋白核小球藻的毒性曲線Fig.1 Toxicity curve of TMT for Chlorela pyrenoidosa

通過機率單位法計算出的不同時間的劑量效應方程(表 1)可知,TMT對蛋白核小球藻急性毒性試驗的各方程相關系數為0.9671～0.9937,具有較好的線性相關性,表明試驗結果準確可靠.根據各相關方程求出 TMT對蛋白核小球藻24,48,72及96h的EC50值分別為0.46,1.27,5.36和 20.9mg/L.按照水生生物毒性分級[15],TMT屬于極高毒性.

表1 TMT對蛋白核小球藻的急性毒性影響Table 1 The acute toxicity of TMT on Chlorela pyrenoidosa

2.2 TMT對大型溞的急性毒性影響

從大型溞48h急性毒性試驗結果可看出(圖2),TMT對大型溞的活動產生了明顯的抑制,并呈現明顯的劑量-效應相關關系.隨著試驗時間的延長和 TMT濃度增加,大型溞的死亡率和抑制率逐漸增加.當 TMT濃度為 0.05mg/L時,48h對大型溞活動產生部分抑制,但無死亡現象;當TMT濃度為0.185mg/L時,24h大型溞的死亡率為60%,抑制率為80%,48h大型溞的死亡率已升到100%.

根據相關方程求得 TMT對大型溞的 24h,48h的 LC50分別為 0.150,0.087mg/L;24h,48h的EC50分別為 0.113,0.063mg/L.參照有關毒性分級[13],TMT對大型溞的毒性屬極高毒性.

圖2 TMT對大型溞的毒性曲線Fig.2 Toxicity curve of TMT for Daphnia magna

表2 TMT對大型溞的急性毒性影響Table 2 The acute toxicity of TMT on Daphnia magna

2.3 TMT對斑馬魚的急性毒性影響

圖3 TMT 對斑馬魚的毒性曲線Fig.3 Toxicity curve of TMT for Danio rerio

從斑馬魚96h急性毒性試驗結果可看出(圖3),TMT對斑馬魚的存活產生了明顯抑制,并呈現明顯的劑量-效應相關關系.隨著試驗時間的延長和 TMT濃度增加,斑馬魚的死亡率逐漸增加.24h的死亡劑量數據與48h,72h,96h的相差較大,當TMT濃度處于2～4.5mg/L之間,24h內對斑馬魚的死亡率沒有明顯的影響,而48h,72h和96h的死亡率處于急劇上升的趨勢,可以看出 TMT對斑馬魚毒性與時間具有較高的相關性.

根據相關方程求得 TMT對斑馬魚的 24h,48h,72h及 96h的 LC50分別為 7.36,4.13,3.06,2.45mg/L;參照有關毒性分級[13],TMT對斑馬魚的毒性屬高毒性.

表3 TMT對斑馬魚的急性毒性影響Table 3 The acute toxicity of TMT on Danio rerio

3 討論

3.1 TMT對3種水生生物毒性效應的比較

TMT對蛋白核小球藻的 96h-EC50為0.46mg/L;對大型溞的 24h-LC50、48h-LC50分別為 0.150和 0.087mg/L;對斑馬魚 96h-LC50為2.45mg/L.根據有關毒性分級[13],TMT對3種水生生物的毒性較高,小球藻和大型溞屬于極高毒,斑馬魚屬高毒.Nagase等[16]報道的 TMT對青鳉的LC50為 5.62mg/L;Hadjispyrou等[5]和 Vighi等[17]報道的TMT對鹵蟲和大型溞的24h-LC50分別為0.22mg/L和0.48mg/L;以上研究結果與本實驗結果吻合.而Wong等[18]報道的TMT對鐮形纖維藻的EC50為5.5mg/L,與小球藻相差較大,這可能是藻種類不同的原因.

就敏感性而言,一般認為,有機錫化合物對藻類敏感性強于水蚤,王珊珊等[19]利用斜生柵藻和大型溞測定 4種丁基錫的毒性時卻發現藻的敏感性明顯高于水蚤.根據文獻[20-22]發現三苯基錫對藻(扁藻、金藻、新月菱形藻和三角褐指藻)的96h-EC50為 1～7μg/L,對大型溞的 24h-EC50為13.33μg/L,即藻敏感性略高于水蚤.本實驗中,以小球藻 96h-EC50、大型溞 48h-LC50和斑馬魚96h-LC50作為 TMT毒性測試指標,可以看出水中不同營養級的生物對TMT的敏感性存在差異大型溞的敏感性最強,蛋白核小球藻和斑馬魚次之.其規律同大多數水生生物毒性測試相似[23],而與大多數有機錫化合物對藻和水蚤的敏感性不同.可見,藻類和水蚤對不同有機錫的敏感性有顯著差異,這與生物本身的生理特點有關,也與不同有機錫的選擇特異性有關.大型溞的毒性效應最強,可能與大型溞表面的疏水性以及 TMT的親脂性和較高的神經毒性[24]有關.

對不同生物的毒性差異表明,建立在食物鏈層次上的綜合水生生態毒性試驗結果,有助于更加全面系統地了解有機錫進入水環境后的生態后果[25].

3.2 TMT的水生態風險性評價

根據歐盟化學物質的風險評價技術指南(TGD)[26]的商值法對自然水體中的TMT進行生態風險評價.評價方法為:首先用3個營養級水平(藻、溞、魚)急性毒性試驗 EC50/LC50值與評價系數(1000)之比預測出無影響濃度(PNEC),再用化學物質的環境濃度(PEC)與PNEC的比值得到風險表征,進而評判化學物質的環境安全性.其中風險表征(PEC/PNEC)＞1時,意味著化學物質對其周邊水體的生物構成了風險.根據歐盟評價方法和本實驗數據預測出TMT對3個營養級的無影響濃度如下:藻(PNEC)為 0.46μg/L;溞(PNEC)為 0.087μg/L;魚(PNEC)為 2.45μg/L.以最低值0.087μg/L作為 TMT對水生生物的無影響濃度.Shawky等[7]對德國北海和易北河水體研究顯示TMT含量在2～11ng/L.Liu等[8]對北京官廳水庫和永定河水體進行研究發現 TMT含量高達0.36μg/L.邱士起等[9]對珠海市某工業區地下水進行調查,能檢出 TMT含量竟高達 0.107mg/L.可以看出,已超過實驗研究的無影響濃度,檢出的TMT其水生態風險不可忽視.據文獻報道[5],TMT具有顯著的生物積累性,鹵蟲體內的含量為水中含量的75倍,TMT還可以和其他污染物(重金屬等)結合具有協同作用增加毒性作用.因此,即使水中 TMT含量不高,不會產生急性毒性,但也存在著通過生物蓄積和食物鏈傳遞而危及人類的潛在風險.隨著有機錫熱穩定劑的大量使用,TMT在中國水體環境中的污染面將不斷擴大并對水生生物乃至人類健康產生潛在的威脅.

4 結論

4.1 TMT對于3種不同營養級的水生生物均有很強的毒性,TMT對蛋白核小球藻的 96h-EC50為 0.46mg/L,屬于極高毒物質;TMT對大型溞的48h-LC50為0.087mg/L,屬于極高毒物質;TMT對斑馬魚96h-LC50為2.45mg/L,屬于高毒物質.且3種水生生物死亡及抑制效應均與TMT的濃度顯著相關,呈明顯的劑量-效應關系.

4.2 不同物種對本次研究的兩種藥物敏感程度不同.本次研究中,大型溞對于TMT最敏感,蛋白核小球藻次之,斑馬魚最弱.

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Toxicity effect of Trimethyltin chloride on aquatic organisms.

LI Zhi-fei1,2, XIE Jun1*, GONG Wang-bao1, YU De-guang1, WANG Guang-jun1, TANG Xiao-jiang3(1.Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China；2.College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China；3.Guangdong Prevention and Treatment Center Occupational Diseases, Guangzhou 510300,China). China Environmental Science, 2011,31(4)：642～646

A study was carried out on the acute toxicity effects of Trimethyltin chloride (TMT) on Chlorela pyrenoidosa,Daphnia magna and Danio rerio. The results suggested that the growth of Chlorela pyrenoidosa was inhibited in the TMT of experimental content, the inhibiting effect increased significantly with the concentration increasing. The part of Chlorela pyrenoidosa cells even would be lethal in the higher concentration group(5.31,20mg/L).The toxic effects of TMT had the highest toxicity to Chlorela pyrenoidosa and Daphnia magna, and the 96h-EC50and 48h-LC50was 0.46mg/L and 0.087mg/L, respectively. while was high-toxic to Danio rerio, the 96h-LC50concentration was 2.45mg/L. EC50/LC50changed regularly with the test time. The two main reasons leading to the potential threat to the aquatic organisms could be the neurotoxicity and lipophilic property of TMT.

TMT；toxicity；Chlorela pyrenoidosa；Daphnia magna；Danio rerio

X503.2

A

1000-6923(2011)04-0642-05

2010-08-17

現代農業產業技術體系建設專項資金項目(nycytx-49-13)廣東省海洋漁業科技推廣項目(A200901D04);國家自然科學基金項目(30771786)

* 責任作者, 研究員, xiejunhy@yahoo.com.cn

李志斐(1983-),男,河南安陽人,上海海洋大學碩士研究生,主要從事生態環境毒理學研究.