磁性多孔微粒對脂肪酶的固定化

陶維紅，楊立榮，徐 剛，邰玉蕾，王 立，吳堅平

（浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江 杭州 310027）

研究開發

磁性多孔微粒對脂肪酶的固定化

陶維紅，楊立榮，徐 剛，邰玉蕾，王 立，吳堅平

（浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江 杭州 310027）

開發了以磁性多孔微粒作為載體固定化脂肪酶的方法，進行了載體的FTIR、XRD、SEM、TEM、BET、TGA和VSM等測定與分析，考察了固定化時間、酶載量和緩沖液pH值等因素對固定化酶在有機相中催化烯丙醇酮轉酯化反應性能的影響。結果表明，制備的磁性微粒是以Fe3O4為磁核，呈現多孔，比表面積12.16 m2/g，平均孔徑為171.7 nm，磁鐵含量38%并為超順磁性；在酶與載體質量比為1∶1、pH值8.0及固定化時間6 h制得固定化酶的效果最佳，固定化酶的活力回收率可達240%。以其作為載體制備獲得固定化酶操作穩定性得到顯著提高，重復利用30批次后殘余活力為74.5%，而游離酶7批次后僅為37.1%。

磁性多孔微粒；節桿菌脂肪酶；酶固定化；轉酯化反應

磁性材料一直被廣泛應用于生物技術和醫學領域[1]。很多生物活性物質，比如酶、蛋白等[2-7]，被固定在磁性載體上，在癌癥治療、基因表達、藥物釋放等領域[8-10]已獲得大量應用。近些年，磁性材料作為生物酶固定化載體被用于酶催化反應發揮著重要作用。將磁性載體用于生物酶的固定化主要優點：所制備的固定化酶較強的磁響應性，從而可以借助外部磁場從反應體系中快速簡便地富集、分離、回收固定化酶，隨時控制酶催化反應，提高酶的使用效率[11]。

納米級的鐵氧化物是使用較為廣泛的一類磁性載體材料，由于其粒徑小、比表面積大、吸附能力強，并能實現超順磁性，因而應用較廣。Dyal等[12]以Fe（CO）為原料，制備出平均尺寸為20～30 nm的γ-Fe2O3納米磁性粒子，對其表面進行化學修飾，共價結合脂肪酶。劉薇等[13]則采用改進的共沉淀法制備了Fe3O4磁性納米粒子（20 nm），分別用于固定酵母乙醇脫氫酶（YADH）和脂肪酶，表現出良好磁分離性，固定化酶的催化活性也優于游離酶。這類單純磁性載體雖然分離效果好，但是分散性不理想，容易團聚，同時對酶的親和性不高，降低了酶的負載量。

近年來磁性高分子微球彌補了這些不足。磁性高分子微粒可通過共聚、表面改性等，賦予其表面多種反應性功能基團，如—COOH、—NH2、—OH、—COH等，與生物活性物質的親和性較高，同時在分散性方面較大改善。孟繁宗等[14]以甲基丙烯酸-2-羥基乙酯為單體，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑，采用光化學方法在磁性液體中制備了Fe3O4磁性聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯微球，粒徑為29.6 nm，大小均勻，分散性好，實現了牛血清白蛋白的固定化。吳俠等[15]制備具有表面功能基的穩定無毒的水溶性磁性復合體系，具有很好的順磁性及生物相容性，成功地固定α-胰凝乳蛋白酶，表現出良好的熱穩定性和操作穩定性。Liu等[16]采用懸浮聚合法將二乙烯基苯和甲基丙烯酸酯與油酸改性的 Fe3O4混合，表面用乙二胺活化后，再以戊二醛連接脂肪酶與載體，固定化酶的載酶量達到34.0 mg/g載體，固定化酶表現出較高的穩定性和重復使用性。

作者采用懸浮聚合法將二乙烯基苯和甲基丙烯酸酯與油酸改性的 Fe3O4混合，引發聚合得到了磁性高分子多孔微球，并對磁性微球的表面形貌及其它性質進行了表征，并將其用于脂肪酶的固定化。希望能夠開發一種新型脂肪酶固定化載體和方法，以提高固定化酶在有機相中的催化活性和穩定性。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

二乙烯基苯（DVB，80%）購自Sigma公司，并通過堿性氧化鋁處理。甲基丙烯酸甲酯（MMA）購自上海化學試劑有限公司，減壓蒸餾后使用。過氧化苯甲酰（BPO）購自上海化學試劑有限公司，并與水重結晶得到。聚乙烯醇（PVA，MW88000）購自Sigma Aldrich。六水三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、四水氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）、氨水（25%）、氯化鈉、辛烷、甲苯、正己烷和油酸購自上海試劑有限公司。脂肪酶ASL（節桿菌脂肪酶）購自中科院微生物研究所。牛血清白蛋白購自Sigma公司。烯丙醇酮（HMPC，4-羥基-3-甲基-2-2-（2-烯丙基）-環戊烯酮，純度＞98.5%）購自常州康美化工有限公司。其它試劑均為化學純，市售。

1.2 油酸包覆的Fe3O4磁性顆粒制備

油酸包覆的 Fe3O4磁性顆粒制備過程參照文獻[16]，通過共沉淀方法，具體為：將FeCl3?6H2O（8.7 g）和FeCl2?4H2O（3.3 g）溶于300 mL去離子水中，通氮氣30 min，升溫至85 ℃并劇烈攪拌后快速加入11.25 mL氨水，反應30 min后，將6.75 mL油酸加入上述反應體系，溫度保持在85 ℃，反應1.5 h。通過磁鐵吸附分離，并用去離子水洗滌5次。最后磁性顆粒分散在3 mL甲苯中，形成穩定的磁流體。

1.3 磁性多孔poly（MMA-co-DVB）微球制備

磁性多孔poly（MMA-co-DVB）微球采用懸浮聚合法制備。具體過程如下：將2.0 g PVA、2.5 g NaCl 攪拌溶于100 mL去離子水中后，向體系內加入2.0 g 上述鐵流體與10 mL MMA、1.5 mL DVB、2 mL環己烷混合液，超聲15 min以形成穩定乳化液。將乳化液轉入三口燒瓶中，并在氮氣保護下攪拌15 min，升溫至到75 ℃，加入0.25 g BPO，反應5 h，得磁性微球，并用去離子水和甲醇洗滌數次后，真空干燥。

1.4 磁性多孔微球表征

紅外（IR）分析：微球的化學鍵信息通過傅里葉變換紅外光光度計（FTIR，Nicolet 5700）測定。

X射線衍射分析：磁性多孔微球通過 D/max-rA衍射儀在室溫下進行測定，掃描范圍2θ為10°～80°。

表面形貌的表征：將制備好的磁性微球分別用掃描電子顯微鏡（SEM，日立S4800）和透射電子顯微鏡（TEM）進行觀察。研究該磁性微粒的表面形貌特征。

比表面積和孔徑分布測定：使用 Micomeritics AUTOSORB-1-C氣體吸附儀測定磁性多孔微球比表面積和孔徑分布通過水銀孔隙度計（Micomeritics Autopore Ⅳ 9500）測定。

熱重（TGA）分析：微球樣品在Perkine-Elmer TGA-7分析儀氮氣保護下從35℃以15 ℃/min速度加熱到600 ℃，進行熱重分析。

磁性能（VSM）測定：微球樣品在室溫下超導量子磁強計測定。

1.5 脂肪酶固定化

將100 mg粗酶ASL溶于20 mL的pH值8.0（0.03 mol/L）磷酸緩沖液中，在4 ℃磁力攪拌20 min，經高速離心（12000 r/min）10 min，取上清液。在上清液中加入 100 mg磁性載體在 28 ℃、100 r/min的搖床中反應6 h，放在永久磁鐵附近5～10 min收集沉淀，用相同緩沖液洗滌3～4次后將沉淀冷凍干燥12 h。放入4 ℃冰箱儲存備用。

1.6 酶活測定

轉酯酶活的測定按照文獻[17]進行。即將 0.8 mmol烯丙醇酮加入到2 mL乙酸乙烯酯中，然后加入80 mg游離酶或固定化酶，200 r/min、40 ℃搖床中反應一定時間（控制轉化率小于 5%），取樣用氣相色譜進行分析。

轉化率：C=e.e.s/（e.e.s+e.e.p）×100%，此處e.e.s和e.e.p分別是底物和產物的對映體過剩值。

單位酶活（U）定義為：在反應條件下 1 min產生1 μmol烯丙醇酮乙酸酯所需要的酶量。比活力（U/g）定義為1 g蛋白所具有的酶活。

1.7 酶的穩定性

操作穩定性實驗：取80 mg游離酶或固定化酶，反應初始階段取樣測定酶活，反應6 h時取樣測定轉化率，游離酶體系12000 r/min離心10 min，回收游離酶；而固定化酶體系通過永久磁鐵吸附回收，并用乙酸乙烯酯溶劑洗滌 2～3次，加入新的反應液，重復進行30批次反應。（以第1次反應酶活為100%）。

熱穩定性實驗：不同溫度下，分別將80 mg酶在2 mL乙酸乙烯酯中保溫12 h，然后測定轉酯活力。

2 結果與分析

2.1 磁性多孔微球表征

圖1 磁性多孔微球的IR表征圖譜

圖2 磁性多孔微球的XRD表征圖譜

磁性多孔微球紅外光譜圖1所示，在579 cm－1處顯示特征吸附峰，對應是Fe3O4中Fe—O鍵的特征吸附峰，結合XRD數據（圖2），磁性多孔微球的X射線衍射峰的位置對應于Fe3O4，表明磁性微球的磁核為Fe3O4。在1620 cm－1和1727 cm－1的特征吸收峰分別對應于二乙烯基苯單體中C=C和甲基丙烯酸甲酯單體中C=O的特征吸收峰。表明油酸修飾的顆粒Fe3O4微球被poly(MMA-co-DVB)聚合物所包覆。并且在聚合過程中的Fe3O4結晶相沒有發生變化。

從磁性微球的TEM圖片[見圖3（c）]可以看出，所得磁性微球是具有核殼結構的球形粒子，并且其表面粗糙多孔[見圖3（b）]，而粗糙多孔表面的形成主要是因為聚合過程中聚合物包覆層所形成孔而造成的。由Micomeritics AUTOSORB-1-C氣體吸附儀以及孔徑分布由水銀孔隙度計，分別對磁性微球的比表面積[根據Brunaurer-Emmmett-Teller（BET）模型計算]和平均孔徑進行測定，結果如圖4所示，其比表面積為12.16 m2/g；平均孔徑為171.7 nm（壓汞法），與掃描電鏡結果一致。從壓汞法數據分析，載體3～50 nm的孔占總孔容積（V）的44.5%，直徑50～200 nm的孔占總孔容積的48.4%，其它孔占總孔容積的7.1%，總孔隙率為13.1%。

圖3 磁性多孔微球的SEM和TEM表征圖譜

圖4 磁性多孔微球的N2吸附/脫附等溫線

圖5 磁性多孔微球TGA曲線圖

為了計算磁性微球中磁鐵含量，進行了熱重分析。如圖5，磁性微球的TGA曲線顯示當溫度加熱到700 ℃油酸和MMA-co-DVB聚合物幾乎完全分解。失重分數曲線可以看出磁性微球中Fe3O4含量約為38%。并且如圖6所示，該磁性聚合物微球的飽和磁化率約為18.12 emu/g，并在室溫下表現出超順磁性的特征，而相對較高Fe3O4含量和超順磁性的特征，使得磁性微球在使用的過程中易于在外界磁場的作用下分離。這對于固定化酶的回收和重復利用極為重要。

圖6 磁性多孔微球磁滯回線

2.2 固定化時間對固定化酶制備的影響

對于氣液兩相水溶液包裹體，測定冰點溫度Tm(ice)和最終均一溫度Tht；利用經驗公式計算或利用實驗相圖確定流體鹽度；利用溫度—鹽度—密度相圖、經驗公式或直接查表求得NaCl-H2O體系的密度；并使用“FLUIDS 1.”軟件包(Bakker，2003)中的“BULK”程序校驗。等容線的計算通過“ISOC”軟件，使用(Bodnar and Vityk，1994)、(Knight and Bodnar，1989)方法計算獲得，該方法試用于H2O-NaCl體系，溫壓試用范圍為100～800℃和0～600MPa，只使用鹽度和均一溫度Tht(℃)即可計算離散壓力-溫度點，擬合等容線(表3)[15]。

圖7為固定化時間對ASL酶固定化效果的影響。可以看出，隨著時間的延長，蛋白吸附量逐漸增加，前2 h內基本呈直線上升，至6 h基本達到飽和值（約8.5 mg/g）。固定化酶的催化活力隨著蛋白吸附量增加而增加，兩者的變化趨勢基本保持一致，在6 h時也達最大（18×103U），隨著時間延長，酶活有所降低。這說明在反應開始階段（2 h內），脂肪酶通過吸附快速結合到載體上，而隨著載體上可結合位點數量的減少，吸附速度明顯下降，超過一定時間后（6 h），固定化酶的轉酯活力反而隨時間延長有所降低。原因一方面脂肪酶在水溶液中不穩定，吸附時間過長導致部分酶失活；另一方面，過多的酶吸附于載體表面，導致載體孔道堵塞，酶蛋白分子相互屏蔽，和底物契合的酶數量減少。綜合考慮固定化效率及固定化酶的轉酯活力，確定固定化最佳時間為6 h。

圖7 固載時間對ASL固定化效果影響

2.3 酶載量對固定化酶制備影響

固定化酶的催化活性不僅與載體的顆粒大小及孔徑等結構性質有關，還受酶加入量的影響[18]。表1為酶量對固定化效果的影響。可以看出，隨著酶量的增加，蛋白吸附率逐漸降低，蛋白吸附量逐漸升高，比活力和活力回收先升高后降。一方面，載體對酶能夠起到良好的分散作用，增加其與底物之間的接觸面積，提高反應速率；另一方面，載體的存在增加了空間位阻，影響底物在酶活性中心區域的接近和定位，從而降低了酶的催化效率。當酶與載體比例過高（4 g/g）時，載體表面容易形成酶聚集體甚至多層酶，導致酶的有效利用率降低；而當酶與載體比例過低（0.125 g/g）時，載體對酶的構象效應可能突顯出來。綜合考慮，確定最佳酶/載體的質量比為 1.0。本文所用磁性載體吸附量大（13.2 mg/g），高于楊光等[17]用硅藻土做載體吸附、包埋和共價等方法固定 ASL時的蛋白吸附量（0.21～0.68 mg/g）。

2.4 pH值對固定化酶制備影響

由于脂肪酶和固定化載體都存在于緩沖液中，而緩沖液的pH值可以改變酶分子和固定化載體的離子化狀態；另外，脂肪酶是蛋白質，當溶液的pH值超過一定范圍時，圍觀結構會發生變化，從而引起酶的失活。因此緩沖液pH值是影響脂肪酶固定化關鍵因素之一。表2為固定化緩沖液pH值對ASL固定化效果的影響。可以看出，在偏酸或過堿時，酶活受到較大影響，酶活回收率顯著下降。有研究表明，蛋白在凍干過程中具有“記憶效應”，并且在有機溶劑中有可能繼續保持這種記憶[19]。也就是說，酶的催化行為與最后一次（比如冷凍干燥前）所處的水溶液的pH值有關。表中可以看出pH值為8.0緩沖液中制備的固定化酶活力、比活力和活力回收是最高。

表1 酶量對固定化酶的影響

表2 pH值對ASL固定化效果的影響

根據以上結果，確定固定化最佳條件為：在酶與載體質量比為1∶1、pH值為8.0磷酸緩沖液及固定化時間 6 h。所得固定化酶轉酯活力為 28.0×103U，比活力為 2.11×106U/g，活力回收是游離酶的2.4倍。

對固定化酶來說，除了催化活力，酶的穩定性尤其是操作穩定性也是影響其能否大規模應用的一個重要因素。圖8顯示固定化酶在有機相中反應時操作穩定性明顯好于游離酶，重復使用30批次后殘余活力依然有74.5%，而游離酶重復6次后殘余活力就不到 50%，重復使用 7批次后殘余活力僅為37.1%。在轉酯反應過程中所產生的副產物醛是導致游離酶和固定化酶失活的一個重要原因[20]。但固定化酶催化性能得到極大提高。一方面，磁性高分子微粒其表面多種反應性功能基團，與生物活性物質脂肪酶的親和性較高（其機制需進一步研究）；另一方面，可能是載體多孔，并且大孔較多（平均孔徑171.7 nm），脂肪酶是大分子，如果載體孔徑小，將會影響固定化過程中酶與載體內部的傳遞過程。由文獻[21-23]發現，孔徑較大的MCF（15.3 nm）的酶固定化比孔徑小的 MCF-41（2.6 nm）效果好。黃磊等[24]以微孔陶瓷載體固定化脂肪酶，僅對部分改性條件優化的情況下，固定化酶活就已經于高貴等[25]用無孔硅藻土固定化脂肪酶的酶活相當。譚天偉等[26]大孔載體固定化假絲酵母脂肪酶，固定化酶的穩定性比游離酶有了明顯提高，在催化月桂酸辛酯合成體系中反應20批次，還有60%剩余活力。

圖8 游離酶和固定化酶在有機相中的操作穩定性

2.6 固定化酶的熱穩定性

在 30～70 ℃范圍內，考察了固定化酶在有機相中的熱穩定性。如圖9所示，40 ℃以下時，游離酶和固定化酶的熱穩定性沒有明顯的差別。當溫度達到50℃時，游離酶迅速失活，殘余活力僅為50%左右，而磁性多孔微球固定化酶活基本沒有損失。總體而言，脂肪酶ASL及固定化酶適合在40℃以下的較低溫度條件下使用，但固定化酶的耐熱能力較游離酶要高。

圖9 游離酶和固定化酶在轉酯反應中熱穩定性

3 結 論

以有機相反應體系中烯丙醇酮轉酯化反應為模型反應，以磁性多孔poly(MMA-co-DVB) 微球固定化脂肪酶，優化了固定化酶制備條件，考察了其操作穩定性。研究表明通過磁性多孔poly(MMA-co-DVB) 微球固定化脂肪酶能夠較好地解決傳質問題，其催化性能得到有效提高。這種新型的磁性多孔材料通過懸浮聚合，制備簡單，易于大規模生產，首次用于固定化脂肪酶ASL，并成功應用于有機相中的轉酯化反應，其操作穩定性極好，分離簡便，有較好的應用前景。

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Immobilization of lipase on magnetic porous microspheres

TAO Weihong，YANG Lirong，XU Gang，TAI Yulei，WANG Li，WU Jianping
（Department of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，Zhejiang，China）

The immobilization ofArthrobactersp.lipase on magnetic porous microspheres was investigated. The magnetic porous microspheres was characterized with FTIR，XRD，SEM，TEM，

BET，TGA and VSM，and the effect of immobilization time，pH，and lipase amount on the catalytic performance of the immobilized lipase in an organic system was studied. The results showed that the core of microsphere was Fe3O4，the surface was porous，the surface area of microsphere was 12.16 m2/g，average pore diameter was 171.7 nm，its magnetic content was 38% and it was super-paramagnetic. The optimal immobilization conditions were determined to be pH 8.0 with the lipase/carrier ratio of 1 to 1（m/m）and immobilization time of 6 h. The activity recovery was as high as 2.4 fold of the free lipase in the resolution of 4-hydroxy-3-methyl-2-（2-propenyl）-2-cyclopenten-1-one. Furthermore，the operational stability of the immobilized enzyme was greatly enhanced compared to the free enzyme. The residual activity was kept at 74.5% after 30 batch reactions，while that of the free enzyme was just 37.1% after 7 batch reactions.

magnetic porous microspheres；Arthrobactersp.lipase；immobilization；tyransesterification

Q 814.2

A

1000–6613（2011）07–1584–07

2011-01-11；修改稿日期：2011-02-07。

國家自然科學基金重點項目（20936002）、國家高技術研究發展計劃（國家 863 計劃，2010AA101502），國家重點基礎研究發展計劃（國家 973 計劃，2011CB710805）及國家科技支撐計劃重點項目（2008BAI63B07）。

陶維紅（1985—），男，碩士研究生。聯系人：吳堅平。E-mail wjp@zju.edu.cn。