血管緊張素-(1-7)與血管緊張素Ⅱ對THP-1巨噬細胞NPC1表達及膽固醇流出的影響*

李 慧， 楊志明△， 肖傳實， 康玉明

(1山西醫科大學第二醫院心血管內科，山西 太原 030001；2西安交通大學醫學院生理學教研室，陜西 西安 710061)

血管緊張素-(1-7)與血管緊張素Ⅱ對THP-1巨噬細胞NPC1表達及膽固醇流出的影響*

李 慧1， 楊志明1△， 肖傳實1， 康玉明2

(1山西醫科大學第二醫院心血管內科，山西 太原 030001；2西安交通大學醫學院生理學教研室，陜西 西安 710061)

目的研究血管緊張素-(1-7) [Ang-(1 -7) ]與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對C型1類尼曼-匹克蛋白(NPC1)表達及膽固醇流出率的影響，探討Ang-(1-7)對AngⅡ在膽固醇逆轉運方面的拮抗作用。方法體外培養的人THP-1單核細胞經佛波酯(PMA)誘導48 h,使之分化為巨噬細胞，隨機分為對照組、AngⅡ組、Ang-(1-7)組、AngⅡ+Ang-(1-7)組和AngⅡ+ Ang-(1-7) + Ang-(1-7)受體阻斷劑A-779組。運用逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)和Western blotting蛋白印記技術分別檢測NPC1 mRNA與蛋白的表達水平，應用液體閃爍計數儀檢測膽固醇流出的變化。結果與對照組相比，AngⅡ能引起THP-1源性巨噬細胞NPC1 mRNA與蛋白質表達的下調及膽固醇流出的減少(P< 0.05)；Ang-(1-7)使NPC1蛋白和mRNA表達升高，膽固醇流出增多(P<0.05) ；混合刺激組中, 不同濃度的Ang-(1-7) ( 100-10 000 nmol/L)呈劑量依賴性地減輕AngⅡ對THP-1源性巨噬細胞 NPC1蛋白和mRNA表達的抑制作用，促進細胞膽固醇流出，與AngⅡ組相比差異顯著(P<0.05) ；加入A-779 組與AngⅡ組比較無顯著差異(P>0.05)。結論Ang-(1-7) 通過其特異性受體Mas拮抗AngⅡ抑制的THP-1巨噬細胞NPC1的表達，并呈濃度依賴性，進而促進巨噬細胞內膽固醇流出,抑制動脈粥樣硬化的發生發展。

血管緊張素Ⅱ； 血管緊張素- (1-7) ； C型1類尼曼-匹克蛋白； 巨噬細胞； 動脈粥樣硬化

C型1類尼曼-匹克蛋白(Niemann-Pick C1 protein,NPC1) 是細胞晚期內體中含有的一個固醇感受域跨膜糖蛋白[1]。內體是膜包裹的囊泡結構,有早期內體和晚期內體之分, 早期內體是由于細胞的內吞作用而形成的含有內吞物質的膜結合的細胞器。在正常細胞中, 低密度脂蛋白經受體介導內吞到達早期內體。隨著胞內體的pH 值下降, 逐漸獲得各種酸性水解酶,形成晚期內體。在晚期內體中, 低密度脂蛋白顆粒解體, 膽固醇酯在酸性水解酶的作用下水解, 釋放出游離的膽固醇。這些膽固醇大部分被運送到質膜, 還有一部分到達內質網和其它位點。NPC1幾乎在每一種組織中都表達[2], 它能識別蛋白質環境中的游離固醇，參與轉運細胞內的膽固醇到細胞膜，進而導致膽固醇流出，促進細胞膽固醇逆向轉運,防止動脈粥樣硬化的形成[3,4]。

血管緊張素Ⅱ(angiotensin II,AngⅡ)能強有力地促進動脈粥樣硬化的發生發展[5]。已有研究證實，AngⅡ是逆轉巨噬細胞內膽固醇外流的關鍵調節因子,強烈促進巨噬細胞的浸潤和泡沫細胞的形成。血管緊張素-(1-7) [Ang-(1-7)]是近年來在腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)中發現的新成員，發揮與AngⅡ相拮抗的作用[6]。本實驗的目的旨在通過觀察Ang-(1-7)與 AngⅡ對人THP-1單核細胞源性巨噬細胞NPC1表達的影響以及對巨噬細胞內膽固醇外流的影響，驗證Ang-(1-7)在防止泡沫細胞形成、抗動脈粥樣硬化中所起的作用。

材 料 和 方 法

1材料

人THP-1單核細胞購自中科院上海細胞庫； AngⅡ、Ang-(1-7) 、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和apoA - I購自Sigma；[3H]標記膽固醇購自Perkin-Elmer；RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購自Gibco-BRL；總RNA提取試劑盒(Transzol)購自Promega；RT - PCR試劑盒購自Fermentas;PCR引物由上海生物工程技術有限公司合成；兔抗人NPC1多克隆抗體購自Santa Cruz；β-actin多克隆抗體購自北京康為世紀科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG購自武漢博士德公司。

2方法

2.1細胞培養及分組 THP-1細胞用含有10%胎牛血清的RPMI - 1640培養液，在37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養。視細胞生長情況適當進行傳代、換液。在每次實驗前用100 nmol/L PMA孵育THP - 1細胞48 h，使其誘導分化成巨噬細胞。用PBS液充分洗滌2次，去除不貼壁細胞及死亡細胞，置于無血清的RPMI-1640培養液中，開始藥物干預實驗。實驗共分5組，(1)對照組: 培養液不加干擾因素; ( 2) AngⅡ組: 加入AngⅡ1 000 nmol/L; (3)Ang-(1-7)組: 加入Ang-(1-7) 1 000 nmol/L; (4)AngⅡ+ Ang-(1-7)組: 分別用Ang-(1-7) 100 nmol/L、1 000 nmol/L、10 000 nmol/L 預處理30 min后,再加入AngⅡ1 000 nmol/L;(5)AngⅡ + Ang-(1-7) + A-779[Ang-(l-7)受體拮抗劑]組: 先用1 000 nmol/L A-779預處理30 min后，再用終濃度為1 000 nmol/L Ang-(1-7)預處理30 min,最后加入終濃度1 000 nmol/L AngⅡ。各組作用24 h后收集細胞，用于NPC1表達及膽固醇流出率的檢測。

2.2RT-PCR法檢測NPC1 mRNA表達 Transzol法提取總RNA，取各組細胞總RNA 2 μL按Fermenas試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，再取1 μL逆轉錄產物進行PCR循環。人THP-1巨噬細胞NPC1引物序列, 上游引物5’-ggtccgcctgtgtactttgt -3’，下游引物5’-tgtccactcgacagcaagac-3’,擴增片段225 bp；人甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物序列，上游引物5’- tgaacgggaagctcactgg-3’，下游引物5’- tccaccaccctgttgctgga -3’，擴增片段為307 bp。PCR反應條件：NPC1(預變性94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，56 ℃ 30 min，72 ℃ 1 min，最后72 ℃ 5 min，共32個循環)，GAPDH(預變性94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 30 min，72 ℃ 1 min，最后72 ℃ 5 min，共32個循環)。反應結束后，取8 μL PCR擴增產物加2 μL 5×上樣緩沖液，于 2.0%瓊脂糖凝膠電泳(60 V，1 h)，溴化乙啶染色，UVP凝膠圖像分析系統掃描攝圖分析,以同管GAPGH為內參照，測定各樣本NPC1 mRNA的相對表達。

2.3Western blotting檢測NPC1蛋白表達 收集不同條件處理的細胞, MBST裂解液裂解細胞, 于4 ℃離心收集，棄除沉淀。配取5%濃縮膠與10%分離膠，上樣量60 μg，用SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離不同分子量的蛋白質，濃縮膠70 V 30 min,分離膠110 V 120 min,當溴酚藍條帶至凝膠底部時，停止電泳。電轉移于NC膜上，麗春紅染色觀察轉移效果,并確定蛋白質分子質量標準位置。封閉液封閉過夜,按1∶1 000加入兔抗人NPC1Ⅰ抗, 4 ℃孵育過夜, TBST洗3次,按1∶10 000 的稀釋倍數加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔Ⅱ抗,室溫孵育3 h, TBST洗3次,用ECL顯色并曝光于X膠片。結果用Gelwork凝膠圖像分析系統對膠片掃描,以同管β-actin為內參照，測定各樣本NPC1的相對表達量。

2.4細胞膽固醇流出測定 膽固醇流出檢測按文獻[7]描述的方法操作, THP-1巨噬細胞用0.37×109Bq /L [3H] 膽固醇及含10%小牛血清的RPMI-1640培養液共同孵育48 h之后,用無菌PBS液洗滌細胞,將細胞計數并隨機分為5組,分別加入無菌PBS (對照) 、1 000 nmol/L AngⅡ、1 000 nmol/L Ang-(1-7)、AngⅡ+Ang -(1-7)、AngⅡ+ Ang-(1-7) + A-779，在含有0.3%BSA的RPMI-1640培養基中靜置培養48 h, 再用PBS 液洗滌細胞, 在無血清的含10 mg/ L 載脂蛋白apoA - I的培養液中繼續培養12 h，閃爍液裂解細胞后，用閃爍計數法檢測培養液和細胞的[3H]膽固醇。膽固醇流出率= {培養液(counts/min)值÷[培養液(counts/min)值+ 細胞(counts/min)值]}×100 %。

3統計學處理

結 果

1THP-1細胞PMA誘導前后形態學變化

光學顯微鏡下觀察，THP-1細胞誘導分化前，細胞呈圓形，懸浮生長。經100 nmol/L PMA 孵育48 h后，細胞由懸浮生長轉化為貼壁生長，呈梭形或不規則形，并伸出偽足，為巨噬細胞外形，見圖1。

Figure 1. The THP-1 monocytes (A) were induced to be macrophages(B) by 100 nmol/L PMA for 48 h(×100)

圖1100nmol/LPMA誘導THP-1單核細胞分化為巨噬細胞

2Ang-(1-7)與AngⅡ對THP-1巨噬細胞NPC1mRNA的表達的影響

與對照組比,AngⅡ組使NPC1 mRNA表達顯著減少(P< 0.05) ;Ang-(1-7)組使NPC1 mRNA表達升高 (P< 0.05) ;混合刺激組中,與AngⅡ組比較,Ang-(1-7) (100 nmol/L、1 000 nmol/L、10 000 nmol/L ) 呈劑量依賴性地減輕AngⅡ對NPC1 mRNA表達的抑制作用(P< 0.05),當Ang-(1-7)濃度達10 000 nmol/L時, NPC1 mRNA表達低于對照組,但無明顯差異(P> 0.05) ;加入A-779組與AngⅡ組比較無顯著差異(P> 0.05),見圖2、表1。

創新推行“一記兩卡三規范”工作法，筑牢監管防線。“一記”即監管人員客觀、完整登記每天監督檢查發現的問題、處理情況。“兩卡”即食品藥品安全信息報告一卡通和便民服務一卡通，每次下到村屯就把“兩卡”分發給監管對象和村民，既能獲取食品藥品安全信息又方便業務咨詢。“三規范”即規范個人形象、規范檔案材料、規范索票索證制度。

3Ang-(1-7)與AngⅡ對THP-1巨噬細胞NPC1蛋白表達的影響

Western blotting印跡方法(圖3)檢測各組細胞NPC1蛋白質的表達，結果見表1，與對照組比,AngⅡ組使NPC1蛋白表達顯著減少(P< 0.05) ;Ang-(1-7)組使NPC1蛋白表達升高(P< 0.05);混合刺激組中,與AngⅡ組比較,Ang-(1-7) (100-10 000 nmol/L)呈劑量依賴性地減輕AngⅡ對NPC1蛋白表達的抑制作用(P< 0.05),當Ang-(1-7)濃度達10 000 nmol/L時, NPC1 mRNA表達低于對照組,但無明顯差異(P> 0.05) ;加入A-779組與AngⅡ組比較無顯著差異(P> 0.05)。

Figure 2. The expression of NPC1 and GAPDH mRNA.M:marker;Lane l:control group;Lane 2:AngⅡgroup;Lane 3:Ang-(1-7)group;Lane 4-6:AngⅡ+Ang-(1-7)(100-10 000 nmol/L)group;Lane 7:AngⅡ+Ang-(1-7)+A-779 group.

圖2各組THP-1源性巨噬細胞NPC1及其內參照GAPDH的mRNA表達

表1Ang-(1-7)與AngⅡ對THP-1源性巨噬細胞NPC1mRNA及蛋白含量的影響

GroupNPC1mRNANPC1proteinControl0．932+0．0590．874+0．071AngⅡ1000nmol/L0．422+0．038#0．436+0．052#Ang-(1-7)1000nmol/L1．064+0．083#0．998+0．061#AngⅡ+Ang-(1-7)100nmol/L0．520+0．041#?0．538+0．045#?AngⅡ+Ang-(1-7)1000nmol/L0．700+0．050#?0．624+0．035#?AngⅡ+Ang-(1-7)10000nmol/L0．908+0．064?0．822+0．033?AngⅡ+Ang-(1-7)+A-7790．450+0．035#0．422+0．033#

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsAngⅡgroup.

Figure 3. Effects of AngⅡand Ang-(1-7)on the protein expression of NPC1 in THP-1 macrophages.1:control group;2:AngⅡgroup;3:Ang-(1-7)group;4-6:AngⅡ+Ang-(1-7)(100-10 000 nmol/L)group;7:AngⅡ+Ang-(1-7)+A-779 group.

圖3各組THP-1源性巨噬細胞NPC-1及其內參照β-actin蛋白的表達

4膽固醇流出的測定結果

結果顯示，與對照組相比，AngⅡ減少巨噬細胞膽固醇流出，Ang-(1-7)增加膽固醇流出(P<0.05)。混合刺激組中, 不同濃度的Ang-(1-7) (100-10 000 nmol/L)呈劑量依賴性地減輕AngⅡ抑制細胞膽固醇流出的作用，與AngⅡ組相比差異顯著(P< 0.05) ；加入A-779 組與AngⅡ組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

討 論

巨噬細胞膽固醇積聚形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化的基礎，因此，促進巨噬細胞的膽固醇流出到細胞膜及細胞外接受體是細胞調節膽固醇水平的一個重要機制，這是膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport,RCT)的第一步。對預防和逆轉粥樣斑塊具有重要意義，這也是近年來藥物治療和干預的重點目標。

表2Ang-(1-7)與AngⅡ對THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出的影響

GroupRaeofcholesterolefflux(%)Control104．62+0．558AngⅡ1000nmol/L7．688+0．479#Ang-(1-7)1000nmol/L15．646+0．890#AngⅡ+Ang-(1-7)100nmol/L9．612+0．651#?AngⅡ+Ang-(1-7)1000nmol/L12．386+0．504#?AngⅡ+Ang-(1-7)10000nmol/L13．916+1．005?AngⅡ+Ang-(1-7)+A-7798．222+0．573#

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsAngⅡgroup.

近年來,由于血管緊張素轉化酶 2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)和血管緊張素-(1-7)的發現,人們對腎素-血管緊張素系統有了新的認識。ACE2/血管緊張素-(1-7) / Mas 受體與血管緊張素轉化酶(ACE) /血管緊張素 Ⅱ/血管緊張素Ⅱ 受體是腎素-血管緊張素系統中既相互抗衡又存在交互作用的重要兩軸。

本實驗以THP-1巨噬細胞為研究對象,以1 000 nmol/L AngⅡ與THP-1巨噬細胞共育24 h后,NPC- 1蛋白表達與對照組比較顯著減少(P< 0.05),NPC 1 mRNA表達與對照組比較亦顯著減少(P< 0.05)。用液體閃爍計數法檢測AngⅡ對THP-1巨噬細胞膽固醇流出率的影響，結果示AngⅡ能顯著減少細胞膽固醇外流。由此可見, AngⅡ在蛋白和基因水平可使THP-1巨噬細胞NPC1表達減少，減少細胞膽固醇外流。

Ang-(1-7)是近年來新發現的RAS中具有生物活性的獨立成員,在體內外均能拮抗AngⅡ的活性,目前認為是AngⅡ的內源性拮抗劑,可以反向平衡AngⅡ引起的升壓、血管收縮、促細胞增殖、水鈉潴留等作用,從而產生降壓、擴血管、抗增殖以及利尿、利鈉等與AngⅡ相反的作用。但Ang-(1-7)是否可以拮抗AngⅡ，增加NPC1的表達，促進膽固醇外流，目前尚不清楚。

本研究從蛋白和mRNA水平,觀察了Ang-(1-7)對AngⅡ誘導的THP-1巨噬細胞NPC1表達的影響。用液體閃爍計數法檢測Ang-(1-7)對THP-1巨噬細胞膽固醇流出率的影響，研究結果顯示, AngⅡ可刺激THP-1巨噬細胞NPC-1蛋白和mRNA 的表達顯著升高，細胞膽固醇流出率減少(P<0.05)。給予不同濃度(100 nmol/L、1 000 nmol/L、10 000 nmol/L ) Ang- ( 1-7 ) 干預后, 呈劑量依賴性地促進AngⅡ抑制的THP-1巨噬細胞NPC1蛋白和mRNA 的表達，增加細胞膽固醇流出率。因此,本實驗從蛋白和基因水平分別證實, Ang-(1-7)可拮抗AngⅡ抑制的THP-1巨噬細胞NPC1的表達，進而增加細胞膽固醇流出率。另外,本實驗另設Ang-(1-7)單獨作用組,將Ang-(1-7)單獨作用組與對照組進行比較,發現Ang-(1-7)亦可促進對照組的蛋白和mRNA的表達,提示Ang-(1 -7)對病理和生理狀態下THP-1巨噬細胞NPC1的表達均有促進作用，且對病理和生理狀態下THP-1巨噬細胞膽固醇流出均有促進作用。

為了研究Ang-(1-7)是否通過自身受體G蛋白偶聯受體Mas[8]發揮抗動脈粥樣硬化的作用,本實驗在Ang-(1-7)干預AngⅡ前,先用Ang-(1-7)的特異性受體阻斷劑A-779預處理30 min后,再觀察NPC1的蛋白和mRNA的表達及膽固醇流出率的情況,并與AngⅡ單獨作用組進行比較,結果顯示,加入A-779組與AngⅡ組比較無顯著差異(P> 0.05),說明A-779可以阻斷Ang-(1-7)拮抗AngⅡ的作用,提示Ang-(1-7)通過其特異性受體發揮此作用。

眾所周知，AngⅡ是促進動脈粥樣硬化發生發展的重要分子。以往的研究主要集中在AngⅡ致AS的炎癥機制，而對于AngⅡ與膽固醇逆轉運研究方面，已有研究證實，與對照組相比，AngⅡ可顯著減少HDL介導的小鼠腹膜巨噬細胞膽固醇流出[9]，降低血漿HDL水平,并且 AngⅡ對THP-1源性泡沫細胞形成起著明顯的促進作用,細胞內膽固醇含量較對照組明顯增加,膽固醇外排率較對照組明顯減少, AT1R拮抗劑厄貝沙坦(Irb)則在一定程度上減輕AngⅡ的致泡沫化作用,使細胞內膽固醇含量較AngⅡ組減少[9,10]。Ang-(1-7) 能否對抗AngⅡ的抑制膽固醇逆轉運的作用,國內外未見相關文獻報道。

NPC1是參與胞內膽固醇運輸和脂類分配的重要蛋白，介導膽固醇從溶酶體向外運輸。NPC1突變可導致人成纖維細胞磷脂和膽固醇流出減少，血漿HDL-C水平下降[11]。本研究結果顯示，AngⅡ可通過減少THP-1巨噬細胞表達NPC1，抑制巨嗜細胞膽固醇外流。Ang-(1-7)可拮抗AngⅡ的上述作用，從而促進巨嗜細胞膽固醇外流，發揮抗動脈粥樣硬化的作用，且此作用通過其特異性受體MAS介導。AngⅡ及Ang-(1-7)影響NPC1表達的信號途徑及膽固醇是如何經過NPC1細胞溶酶體蛋白N末端的構造改變來穿過細胞膜的有待進一步研究，這將為動脈粥樣硬化提供新的治療思路。

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Influenceofangiotensin-(1-7)andangiotensinIIonexpressionofNPC1andcholesteroleffluxinTHP-1macrophages

LI Hui1, YANG Zhi-ming1, XIAO Chuan-shi1, KANG Yu-ming2

(1DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofPhysiology,Xi’anJiaotongUniversityCollegeofMedicine,Xi’an710061,China.E-mail:zhimingyang800@sina.com)

AIM: To investigate the effects of angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] and angiotensin II (Ang II) on the expression of NPC1 in THP-1 macrophages. The rate of cholesterol effluent was also observed.METHODSThe macrophages were derived from THP-1 monocytes induced by phorbol myristate acetate for 48 h and then the cells were randomly divided into control group, Ang II group, Ang-(1-7) group, Ang-(1-7) + Ang II group, and Ang-(1-7) + Ang II+A-779 [a specific antagonist of Ang-(1-7)receptor] group. The expression of NPC1 at mRNA and protein levels was determined by reverse transcription- polymerase chain reaction (RT- PCR) and Western blotting, respectively. Cholesterol effluent was measured by liquid scintillation counting.RESULTSCompared with control group, the expression of NPC1 at mRNA and protein levels was significantly down-regulated in Ang II group and the effluent rate of cholesterol was also decreased (P<0.05). Ang-(1-7) dose-dependently inhibited the reduction of NPC1 induced by Ang II, and promoted the cholesterol efflux (P<0.05). However, when incubated with A-799, the effect of Ang-(1-7) on inhibiting the mRNA expression of NPC1 was significantly attenuated.CONCLUSIONThe present study indicates that Ang-(1-7) down-regulates the expression of NPC1 dose-dependently in THP-1 macrophages induced by Ang II via its specific receptor Mas and contributes to the process of anti-atherosclerosis.

Angiotensin II; Angiotensin-(1-7); Niemann-Pick C1 protein; Macrophages; Atherosclerosis

R541. 4

A

1000-4718(2011)03-0455-05

2010-09-30

2011-01-12

山西省科技攻關資助項目(No.20100311098-4)

△通訊作者Tel: 0351- 3365536; E - mail: zhimingyang800@sina.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.007