固相轉染HPV16-siRNA對荷宮頸癌細胞SiHa小鼠瘤體體積及P53、P16表達的影響*

廖百花, 馮亦軍, 曾祿賢， 肖小敏

(1 廣東省第二人民醫院婦科， 廣東 廣州 510317；2暨南大學第一臨床學院婦產科， 廣東 廣州510633)

固相轉染HPV16-siRNA對荷宮頸癌細胞SiHa小鼠瘤體體積及P53、P16表達的影響*

廖百花1, 馮亦軍1, 曾祿賢1， 肖小敏2△

(1廣東省第二人民醫院婦科， 廣東 廣州 510317；2暨南大學第一臨床學院婦產科， 廣東 廣州510633)

目的觀察靶向基因治療后不同時點荷宮頸癌細胞小鼠HPV16-DNA、瘤體體積、P53及P16蛋白的變化，探討在體固相轉染HPV16-siRNA的有效性。方法采用 SiHa細胞皮下注射建立荷宮頸癌細胞SCID小鼠模型。制備HPV16靶向siRNA-Lipo2000-卡波姆凝膠。將40只荷宮頸癌細胞SCID小鼠隨機分為對照組8只和研究組32只和研究組使用HPV16靶向siRNA-Lipo2000-卡波姆凝膠進行基因治療，對照組僅使用Lipo2000-卡波姆凝膠處理；分別于治療后4 d、8 d、12 d、16 d處死小鼠，每個時點研究組處死8只、對照組處死2只。PCR檢測兩組小鼠瘤體中HPV16-DNA滴度，測各時點的瘤體體積，常規病理切片檢測腫瘤細胞形態，免疫組化檢測P16及P53的表達。結果(1)研究組治療后8 d及12 d時點瘤體內HPV16-DNA明顯降低，與對照組之間的差異顯著(P<0.05)，4 d及16 d 2個時點與對照組之間的差異不顯著(P>0.05)；(2)治療后12 d瘤體平均體積明顯縮小，與對照組之間的差異顯著(P<0.05)；(3)轉染后12 d腫瘤細胞核異質性較對照組減輕，核漿比例減小；(4)P16的表達強度在各時點研究組與對照組之間的差異不顯著(P>0.05)；治療后8 d及12 d研究組P53 的表達強度明顯降低，與對照組之間的差異顯著(P<0.05)。結論SCID小鼠所荷宮頸癌細胞瘤體經靶向轉染HPV16-siRNA后8 d及12 d時點瘤體內HPV16-DNA和P53均較對照組明顯下降，12 d瘤體體積較對照組明顯下降；在體固相轉染siRNA可以在一定時段內有效抑制HPV-DNA的復制及腫瘤的生長速度。

宮頸腫瘤； RNA干擾； 人乳頭狀瘤病毒； P53蛋白; P16蛋白

人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染與宮頸癌關系密切，但無有效臨床治療方法；近年來的研究發現，RNA干擾(RNA interference，RNAi)能有效抑制HPV復制[1-3]，為宮頸持續性HPV感染的治療提供了新的策略及理論依據。但目前眾多的研究均是在液相條件下對離體細胞進行轉染實驗，在體細胞進行固相siRNA轉染的研究目前鮮見報道。前期我們設計了一種含HPV16 靶向siRNA的局部外用藥，并證實可以經固相途徑轉染siRNA進入宮頸上皮；利用該法對荷宮頸癌SCID小鼠瘤體進行基因治療，發現轉染后7 d治療組小鼠瘤體組織中HPV 16-DNA的滴度較對照組明顯降低[4]。由于宮頸HPV感染動物模型目前尚未建立，同類研究多采用HPV陽性腫瘤細胞(如SiHa細胞)對SCID小鼠皮下注射建立荷宮頸癌模型進行[5，6]；本研究繼續利用荷宮頸癌細胞小鼠模型進行固相轉染基因治療，檢測治療后不同時點(轉染后4 d、8 d、12 d、16 d)HPV16-DNA,結合宮頸癌瘤體體積、病理以及P16、P53的表達等情況，進一步探討在體細胞固相轉染siRNA的有效性。

P16是近年來發現的多種腫瘤抑制基因，參與細胞周期的調控，控制細胞的生長與分化，直接參與腫瘤的形成與進展。有研究[7]探討了CIN及子宮頸癌中P16表達及其意義，結果顯示：P16陽性表達率從子宮頸正常組、CIN I組、CIN II組、CINⅢ組呈上升趨勢，與子宮頸正常組比較，P16的陽性表達率差異均顯著(P<0.01)，提示P16的高表達是子宮頸正常組織向CIN、宮頸癌發生過程中的早期事件，研究者認為P16蛋白表達異常可作為臨床評價腫瘤生物學行為及判斷預后的輔助指標。P53基因是重要的抑癌基因，作為轉錄因子，通過阻止細胞復制和發動細胞凋亡保持基因組的穩定性，維持細胞正常生長，抑制細胞惡性增殖，對生長起負調節作用。若該基因由于突變、丟失或重排而失活，細胞可能發生惡性轉變；它的失活表現為突變型P53的過度表達。突變型P53蛋白不僅失去了正常的抑癌作用，而且具有促進正常細胞惡性轉化的作用[8，9]。所以，我們把P16及P53蛋白作為本次研究的檢測指標之一。

材 料 和 方 法

1材料

1.1siRNA的設計及標記 siRNA由廣州銳博生物科技有限公司設計并合成(針對HPV16，設計長度為21nt)，正義鏈5′-GAGGTATATGACTITGCTTdTdT-3′,反義鏈3′-AAGCAAAGTCATATACCTCdTdT-5′,批號為siL09330161940， 20 nmol/瓶， MV: 13797.91,-20 ℃密封保存。

1.2材料 LipofectamineTM2000， Invitrogen產品(批號為534294;規格:1.5 mL/支,1 g/L;-20 ℃保存)。 三乙醇胺:天津市富宇精細化工有限公司(批號為 090407);卡波姆940為Mbchem產品(批號為 20080228)。 SiHa細胞由南方醫科大學婦產科教研室尹倩碩士饋贈。SCID純系小鼠40只，購自中山大學動物實驗中心，4-6周齡，雌性，按普通級清潔飼養(合格證號為2008A153)。單克隆小鼠抗人P16/P53蛋白Ⅰ抗、Ⅱ抗試劑均購自Dako。

2方法

2.1建立荷宮頸癌裸鼠模型[10]SiHa細胞于RPMI-1640全培養基中培養， 其中含胎牛血清濃度為10%,青霉素1×105U/L, 鏈霉素100 mg/L,在恒溫培養箱中以5% CO2、37 ℃及飽和濕度條件下培養4-5 d，胰酶消化，用PBS重懸細胞并調細胞密度為5×1010cells/L,于SCID小鼠側肋部接種，接種量為0.1 mL，飼養21 d，制作宮頸癌裸鼠模型。成瘤期平均 18 d，成瘤率100%。

2.2藥物配制 第1步:取6 μL LipofectamineTM2000加注射雙蒸水稀釋至100 μL。第2步: HPV16-siRNA加雙蒸水1 mL稀釋，稀釋后取50 μL HPV16-siRNA溶液加50 μL LipofectamineTM2000的溶液配成HPV16-siRNA-LipofectamineTM2000混合液。第3步: HPV16-siRNA-LipofectamineTM2000-卡波姆凝膠劑配制:取卡波姆940凝膠1 g，甘油10 g，置于研缽中研勻，并加適量蒸餾水，慢慢滴加三乙醇胺，邊加邊攪，使成凝膠， 加蒸餾水至20 g，剛好形成凝膠。取0.5 g凝膠，加人 10 μL HPV16-siRNA-脂質體適量攪勻，配制成HPV16-siRNA-LipofectamineTM2000-卡波姆凝膠劑(每天治療前30 min配制好即可)。

2.3方法 將40只荷瘤SCID小鼠隨機分為研究組(n=32)及對照組(n=8)，以游標卡尺分別測量瘤體的最長徑線(a)和最短徑線(b)，并記錄相關數據；研究組小鼠每天在瘤體表面涂HPV16-siRNA-LipofectamineTM2000-卡波姆凝膠劑0.5 mL，再以無菌輸液貼覆蓋瘤體,避免凝膠脫失，共7 d；對照組瘤體表面僅涂LipofectamineTM2000-卡波姆凝膠，每天1次，共7 d，方法同研究組。對照組與研究小鼠均隨機分為4組(研究組n=8、對照組n=2)，分別于治療結束后4 d、8 d、12 d和16 d處死，按治療前方法測瘤體徑線后取瘤體組織，一部分石蠟包埋供免疫組化檢測P16、P53蛋白及常規病理檢查觀察細胞形態，其余部分存-20℃冰箱待檢HPV-DNA。常規酚、氯仿法抽提組織DNA,PCR 檢測HPV16-DNA滴度，免疫組化檢測P16及P53表達，圖像分析采用申洪[11]方法測陽性單位(PU值)。腫瘤體積 (tumor volume, TV)的計算公式為：TV=ab2/2[12]。

3統計學處理

結 果

1治療后研究組與對照組不同時點宮頸癌瘤體內HPV16-DNA的變化

研究組小鼠瘤體內HPV16-DNA在治療后8 d和12 d明顯下降，與對照組之間的差異顯著(P<0.01)，見表1。

表1研究組與對照組SCID小鼠治療后4d、8d、12d和16d瘤體內HPV16-DNA的變化

GroupHPV16-DNAsiRNAtransfection(4d)15．10±7．11siRNAtransfection(8d)3．23±3．86?siRNAtransfection(12d)6．00±4．37?siRNAtransfection(16d)10．80±7．58Control17．90±4．36

*P<0.05vscontrol group.

2對照組與研究組治療后4d、8d、12d和16d宮頸癌瘤體體積的變化

研究組轉染siRNA后12 d瘤體平均體積縮小，與對照組之間差異顯著(P<0.05)；轉染siRNA 8 d和16 d瘤體體積雖然也縮小,但與對照組之間無顯著差異,見表2。

表2對照組與研究組治療后4d、8d、12d和16d宮頸癌瘤體體積的變化

GroupBeforetreatmentAftertreatmentsiRNAtransfection(4d)404．15±17．26415．50±12．31siRNAtransfection(8d)412．01±15．11389．89±14．71siRNAtransfection(12d)399．22±21．18361．22±11．91?siRNAtransfection(16d)422．04±19．56382．49±24．16Control409．52±15．95443．21±43．33

*P<0.05vscontrol group.

3對照組與研究組治療后12d病理改變

研究組轉染后12 d腫瘤細胞體積較對照組縮小，細胞核變小，核異質性較對照組減輕，核漿比例減小，胞漿染色較對照組變淺, 見圖1。

Figure 1. The dyskaryosis of tumor cells in experimental group became mild,and karyoplasmic ratio diminished at 12d after transfection (HE staining,×100). A: experimental group; B：control group.

圖1轉染后12d研究組與對照組腫瘤細胞形態

4治療后研究組和對照組宮頸癌瘤體內P16和P53蛋白的表達

P16的表達強度在各時點對照組與研究組之間均無顯著差異(P>0.05)，研究組P53的表達強度在轉染后8 d和12 d較對照組明顯降低，差異顯著(P<0.05)，見表3，圖2、3。

表3研究組與對照組治療后不同時點宮頸癌瘤體內P16和P53蛋白的表達

GroupP16proteinP53proteinsiRNAtransfection(4d)28．56±5．5121．42±6．71siRNAtransfection(8d)27．57±3．0516．44±5．37?siRNAtransfection(12d)19．25±2．1915．97±8．83?siRNAtransfection(16d)20．66±2．1518．32±6．54Control28．52±5．9529．58±7．74

*P<0.05vscontrol group.

Figure 2. The expression of P16 proteins in cervical tumor of SCID mice in control group and experimental group(×400). A：4 d after siRNA transfection; B: 8 d after siRNA transfection; C: 12 d after siRNA transfection; D: 16 d after siRNA transfection; E: control group.

圖2P16蛋白表達

Figure 3. The expression of P53 protein in cervical tumor of SCID mice in control group and in experimental group(×400). A: control group; B：4 d after siRNA transfection; C: 8 d after siRNA transfection; E: 12 d after siRNA transfection; F: 16 d after siRNA transfection.

圖3P53蛋白表達

討 論

RNA干擾可有效引起靶向基因沉默[13]，液相離體細胞轉染siRNA的許多研究[14,15]均已證實靶向轉染RNA可有效抑制HPV的復制，但目前在體固相轉染的研究報道不多見。

我們前期的實驗[4]結果提示，siRNA可由固相經脂質體轉染入兔宮頸上皮組織中。本研究結果顯示，HPV-DNA的滴度在染后4 d開始下降，到8 d達到最低、持續到轉染后12 d開始回升，轉染后16 d達新高。轉染后8 d及12 d時瘤體內HPV-DNA的滴度較對照組明顯降低，差異顯著，這與Jiang等[1]研究一致；說明經基因治療后8 d可使HPV的復制明顯抑制、持續時間可達4 d。如果利用靶向siRNA技術對宮頸高危型HPV持續性感染的患者進行基因治療，這段時間足以使病毒基因表達所抑制的細胞調節機制恢復，有利于機體選擇性殺死病毒感染細胞，清除宮頸鱗-柱交界處的HPV。

研究還顯示：隨瘤體內HPV16復制活性的降低，治療后12 d宮頸癌瘤體體積較對照組明顯減小；常規病理檢查細胞形態發現研究組在治療后12 d腫瘤細胞的異質性減輕、核漿比例減小。腫瘤體積是評價化學或生物治療腫瘤效應的常用指標，我們的實驗結果顯示研究組轉染HPV16-siRNA后8 d、12 d、16 d時瘤體平均體積均較對照組縮小；其中轉染后12 d的瘤體平均體積與對照組之間差異顯著，說明固相轉染HPV16-siRNA可在一定時段內有效抑制腫瘤生長。

P53基因突變在多種惡性腫瘤常見，一般免疫組化方法檢測出的P53蛋白均顯示為突變型，它的結構改變與表達異常可能是腫瘤發生發展的重要環節[16，17]；我們研究顯示P53蛋白也在轉染靶向siRNA后8 d及12 d出現下降趨勢；上述指標出現改變的時間與HPV16-DNA下降相一致。

本研究發現，P16蛋白的表達強度雖然在治療后隨HPV16-DNA的下降也出現降低趨勢，與Prowse等[18]在探討宮頸鱗癌高危HPV和P16表達關系中的發現一致，說明P16的過表達是繼發于HPV表達的事件。但其在治療后各個時點與對照組之間均無顯著差異，與Mulvany等[7]的研究不相一致，可能的原因還需進一步研究；但從我們對P53蛋白的表達對比來看，P16蛋白作為臨床評價腫瘤生物學行為及判斷預后的輔助指標，其穩定性還有待探討。

總之，實驗證實固相轉染靶向HPV16-siRNA在一定的時段內能有效抑制瘤體中HPV16的復制和瘤體的生長速度, 改善腫瘤細胞的異質性，降低P53蛋白表達,從側面證實了固相轉染靶向HPV16-siRNA的有效性。可為臨床使用RNA干擾治療宮頸持續性HPV感染，預防宮頸癌提供理論依據。

(致謝：在本實驗進行過程中，南方醫科大學病理教研室的申洪教授在百忙中給我們提供了諸多的幫助，在此表示衷心的感謝。)

[1] Jiang M, Milner J. Selective silencing of viral gene exp-ression in HPV-positive human cervical carcinoma cells treated with siRNA, a primer of RNA interference [J].Oncogene, 2002, 21 (39): 6041-6048.

[2] Bousarghin L, Touze A, Gaud G, et al. Inhibition of cervical cancer cell growth by human papillomavirus virus-like particles packaged with human papillomavirus oncoprotein short hairpin RNAs[J]. Mol Cancer Ther, 2009, 8(2): 357-365.

[3] 官立麗, 彭芝蘭, 牛曉宇. HPV16 E6小干擾RNA對人宮頸癌裸鼠移植瘤的抑制作用[J]. 中華腫瘤雜志,2007, 29 (12): 894-897.

[4] 廖百花，馮亦軍，肖小敏.兔宮頸固相轉染靶向HPV16 siRNA抑制荷宮頸癌SCID小鼠HPV的復制[J]. 中國病理生理雜志，2010, 26 (4): 695-699.

[5] Bermúdez-Morales VH, Peralta-Zaragoza O, Guzmán-Olea E,et al. HPV 16 E2 protein induces apoptosis in human and murine HPV 16 transformed epithelial cells and has antitumoral effectsinvivo[J]. Tumor Biol,2009,30(2):61-72.

[6] 趙艷忠，張為遠.人宮頸鱗狀細胞癌裸鼠移植模型的建立及分析[J]. 中國婦幼保健,2010,25(27):3970-3973.

[7] Mulvany NJ，Mien DG，Wilson SM．Diagnostic utility of p16lNK4a：a reappraisal of its use in cervical biopsies[J]．Pathology，2008，40(4)：335-344．

[8] Lung FW, Shu BC, Kao WT, et al. Association of DRD4 uVNTR and TP53 codon 72 polymorphisms with schizophrenia: a case-control study [J]. BMC Med Genet, 2009,10:147.

[9] Michalak EM, Villunger A, Adams JM, et al. In several cell types tumor suppressor P53 induces apoptosis largely via Puma but Noxa can contribute [J]. Cell Death Differ, 2008, 15(6):1019-1029.

[10]周堅紅, 陳懷增, 程 琪,等.HPV16 E7肽疫苗對人免疫重建荷人宮頸癌細胞株SiHa細胞SCID鼠免疫功能的影響[J].現代婦產科進展,2005，14(5):353-357.

[11]申 洪．免疫組織化學染色定量方法研究(Ⅲ)[J].中國組織化學與細胞化學雜志,1995,4(1):89-92.

[12]Park R, Chang CC, Liang YC，et al.Systemic treatment with tetra-O-methyl nordihydroguaiaretic acid suppresses the growth of human xenograft tumors[J]. Clin Cancer Res，2005,11(12):4601-4609.

[13]Tijsteman M, Ketting RF, Okihara KL, et al. RNA heli-case MUT-14-dependent gene silencing triggered inC.elegansby short antisense RNAs[J]. Science, 2002, 295(5555): 694-697.

[14]張美紅, 周克元. RNA干擾阻抑Bax inhibitor-1(bi-1)基因表達對卵巢癌細胞凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25 (4):670-675.

[15]練 兵, 王繼群, 金 琳. 靶向PCNA基因的小干擾RNA對鼻咽癌CNE2細胞周期的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25 (8): 1533-1537.

[16]Takimoto R，Wang W，Dicker DT，et al．The mutant P53-conformation modifying drug,CP-31398，can induce apoptosis of human cancer cells and can stabilize wild-type P53 protein[J]．Cancer Biol Ther,2002，1(1)：47-55．

[17]朱鳳琴，鳳 林，胡向陽.P16、P53在宮頸上皮內瘤變和浸潤性鱗癌中的表達及意義[J].安徽醫科大學學報， 2009，44(2)：201-204.

[18]Prowse DM,Ktori EN,Chandrasekaran D，el al．Human papillomavirus-associated increase in p16lNK4Aexpression in penile lichen sclemsus and squamous cell carcinoma [J]．Br J Dermatol,2008，158(2)：261-265．

siRNAinhibitsHPV16-DNAreplication,tumorvolumeandexpressionofP16andP53inSCIDmicewithSiHacellcervicalcarcinomainvivo

LIAO Bai-hua1, FENG Yi-jun1, ZENG LU-xian1, XIAO Xiao-min2

(1DepartmentofGynecology,GuangdongNo. 2ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou510317,China;2DepartmentofGynecologyandObstetrics,TheFirstAffiliatedClinicalCollege,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xiaoxiaomin55@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of targeting gene therapy on mouse SiHa cell cervical carcinoma by transfecting siRNA into the tumor with solid-phase methodinvivo.METHODSA sense strand siRNA (21 nt) for human papilloma virus type 16 (HPV16) was designed. siRNA-Lipo2000-carbomer gum was prepared. Forty SCID mice with SiHa cell cervical carcinoma were divided into experimental group (n=32) and control group (n=8). The diameter and volume of the tumors were measured before treatment. The mice in experimental group were treated with siRNA-Lipo 2000-carbomer gum for 7 d. The control mice were treated with Lipo 2000-carbomer gum for 7 d. The mice in experimental group and control group were sacrificed at the time points of 4 d, 8 d, 12 d and 16 d after treatment. The diameter and volume of the tumors were measured again. The HPV16-DNA in the tumor tissues was measured by PCR. The protein levels of P16 and P53 in the tumors were determined by the method of immunohistochemistry.RESULTSCompared with control group, the titer of HPV16-DNA decreased significantly at the time points of 8 d and 12 d after transfection in experimental group (P<0.05). The protein expression of P16 in experimental group showed decreased tendency 8 d and 12 d after transfection, but without statistical difference. The protein expression of P53 significantly decreased 8 d and 12 d after transfection. The tumor volume in experimental group was significantly decreased as compared to that in control group at the time point of 12 d (P<0.05). Transfection of siRNA for 12 d resulted in attenuating dyskaryosis and karyoplasmic ratio of the tumor cells.CONCLUSIONSolid-phase transfaction of siRNAinvivoinhibits HPV-DNA replication and growth of SiHa cell cervical carcinoma.

Cervix neoplasms; RNA interference; Human papilloma virus; Protein P53; Protein P16

R737.33

A

1000-4718(2011)03-0509-05

2010-10-01

2011-01-19

廣東省醫學科研基金資助項目(No.A2008142)

△通訊作者 Tel：020-38688607;E-mail: xiaoxiaomin55@hotmail.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.017