肝癌SMMC-7721細胞中側群細胞分選及其生物學特性的研究*

黃 濤, 周 奇， 宮東偉， 高全立， 張旭華, 呂曉東， 周進學

(鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南省腫瘤醫院 1肝膽胰外科，4生物治療科,5中心實驗室，河南 鄭州 450000；2中山大學第一附屬醫院肝膽外科，廣東 廣州 510080；3新鄉醫學院第三附屬醫院普外科，河南 新鄉 453003)

肝癌SMMC-7721細胞中側群細胞分選及其生物學特性的研究*

黃 濤1△, 周 奇2， 宮東偉3， 高全立4， 張旭華5, 呂曉東5， 周進學1

(鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南省腫瘤醫院1肝膽胰外科，4生物治療科,5中心實驗室，河南 鄭州 450000；2中山大學第一附屬醫院肝膽外科，廣東 廣州 510080；3新鄉醫學院第三附屬醫院普外科，河南 新鄉 453003)

目的分選肝癌SMMC-7721細胞中的側群(SP)細胞并分析其生物學特性。方法采用流式細胞熒光激活分選(FACS)技術將SMMC-7721細胞分為SP細胞和非側群(NSP)細胞2個亞群。細胞生長曲線法和平板克隆法比較SP細胞和NSP細胞的增殖能力和克隆形成能力；Transwell法檢測SP細胞和NSP細胞的遷移及侵襲能力；流式細胞術分析細胞周期及細胞凋亡率；裸鼠體內成瘤實驗比較SP細胞和NSP細胞的致瘤性。結果SMMC-7721細胞中分選出的SP細胞比例為(9.2±0.2)%。SP細胞中G0/G1期細胞比例高于NSP細胞，凋亡率低于NSP細胞(P<0.05)；SP細胞的增殖速度、克隆形成能力、體外遷移和侵襲能力均明顯高于NSP細胞(P<0.05)；裸鼠成瘤實驗顯示SP細胞的致瘤能力明顯高于NSP細胞。結論肝癌SMMC-7721細胞中的SP細胞可能富集了肝癌干細胞。

肝腫瘤； 側群細胞； 腫瘤干細胞； SMMC-7721細胞

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是目前死亡率位列第3的惡性腫瘤，具有手術切除率低、術后復發率高及放化療不敏感等臨床特點，探索新的治療方法是提高HCC患者生存率的關鍵。腫瘤干細胞理論認為腫瘤是由分化程度不同的細胞構成的，僅少數細胞即腫瘤干細胞有形成腫瘤的能力，是腫瘤耐藥及復發的根源[1]。如果利用特異標記找到HCC干細胞并以此為靶點進行治療，可能有望攻克HCC。側群(side population, SP)細胞是一種特殊類型的干細胞，因其能將Hoechst 33342排出細胞而呈弱染狀態[2]。在缺乏特異標記的情況下，SP細胞分選和分析成為研究HCC干細胞的一種實用而重要的方法。本研究利用SP細胞的弱染特性將其從肝癌SMMC-7721細胞中分選出來，并對其生物學特性進行研究，為肝癌干細胞理論提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1材料與試劑

人肝癌SMMC-7721細胞來自上海中科院細胞庫，保存于河南省腫瘤醫院中心實驗室。RPMI-1640培養基購自Gibco公司。胎牛血清購自鄭州益康公司。胰蛋白酶粉購自鄭州寶信公司。碘化丙啶(PI)、維拉帕米(verapamil)、Hoechst33342購自Sigma。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽公司。Transwell小室購自Corning。Matrigel和FACS AriaⅡ流式細胞儀購自BD。CO2恒溫細胞培養箱購自Revco。臺式離心機購自Beckman。裸鼠購自中科院動物研究所。

2細胞培養

肝癌SMMC-7721細胞以含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的RPMI-1640培養基在37 ℃、飽和濕度、5% CO2孵箱內培養，每3-4 d傳代1次。

3流式細胞熒光激活分選

取對數生長期細胞，調整細胞密度至1×109cells/L，實驗組加入Hoechst33342至終濃度2.5mg/L，對照組再加入verapamil至終濃度100 mg/L，以拮抗SP細胞外排Hoechst33342的特性。 37 ℃水浴60 min，期間每隔15 min振動混勻細胞1次。用PBS洗滌離心1次，重懸于冰冷的RPMI-1640培養基中，上機檢測前加入PI至終濃度1 mg/L。詳細操作及SP細胞檢測參照文獻[3]，在活細胞中收集SP細胞和非SP(NSP)細胞。

4生長曲線繪制及克隆形成能力比較

將前1 d分選的SP細胞和NSP細胞制備成單細胞懸液，分別接種于24孔板中，每孔1×104個細胞。每隔24 h SP細胞和NSP細胞各取3孔進行細胞計數，計算平均值。8 d后以培養時間為橫坐標，細胞數為縱坐標繪制SP細胞和NSP細胞的生長曲線。

將分選的SP細胞和NSP細胞分別接種于6孔板，每孔200個細胞，培養14 d后進行Giemsa染色并計數大于50個細胞的克隆，計算克隆形成率(colony fformation efficiency，CFE)，CFE=克隆形成數/接種細胞數×100%。

5Transwell小室遷移侵襲實驗

采用帶有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室進行遷移實驗。按5×108cells/L的濃度將對數生長期的SP細胞和NSP細胞用無血清RPMI-1640培養基制備成單細胞懸液。上室各孔中加入100 μL細胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，孵箱中培養48 h后自24孔板中取出上室，用棉簽擦去微孔膜上室面的細胞，然后將小室置于95%乙醇中固定15 min，蘇木素染色15 min，于200倍光鏡下隨機選擇5個視野計數穿膜細胞，取平均值。每組實驗重復3次。

Transwell小室侵襲實驗中按1∶3的比例混合matrigel和無血清RPMI-1640培養基，于上室加入50 μL混合液，37 ℃孵育2 h使其凝固，制成人工基底膜。其它步驟同Transwell遷移實驗。

6細胞周期檢測

胰酶消化并離心收集前1 d分選出的SP細胞和NSP細胞，預冷PBS洗細胞2次后懸于0.5 mL PBS中。將0.5 mL細胞懸液緩緩滴加入4 mL預冷的75%乙醇中，于4 ℃固定2 h以上。離心收集固定后的細胞，PBS洗細胞1次，加入1 mL PI染色液，室溫避光孵育30 min，然后直接上流式細胞儀檢測。計數2-3萬個細胞，用細胞周期分析軟件計算處于G0/G1、S和G2/M期的細胞比例。

7細胞凋亡檢測

將前1 d分選的SP細胞和NSP細胞用0.25%胰蛋白酶消化，分別制成單個細胞懸液，然后收集細胞，用PBS 洗滌2 次。將細胞重懸于200 μL 結合緩沖液。加入10 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，避光室溫反應15 min。加入300 μL 結合緩沖液和5 μL PI，立即上流式細胞儀檢測。用細胞凋亡分析軟件計算Annexin V+細胞的比例。

8裸鼠成瘤實驗

將裸鼠隨機分組，每組6只。將分選的SP細胞和NSP細胞按1×105、1×104和1×103的數量分別注射到裸鼠背部皮下，每3 d觀察1次腫瘤形成情況，連續4周。

9統計學處理

結 果

1人肝癌SMMC-7721細胞中SP細胞的分選

SP細胞能排出熒光染料Hoechst33342而呈弱染狀態，位于流式圖的左下角熒光弱染區。SMMC-7721細胞中SP細胞的比例為(9.2±0.2)%，對照組加verapamil，抑制了細胞轉運蛋白的功能，從而改變了SP細胞外排熒光染料的特性，使SP細胞比例減少至(0.0±0.0)%，見圖1。用離心管收集分選的SP細胞和NSP細胞備用。

Figure 1. Analysis of side population (SP) cells among SMMC-7721 cells by fluorescence-activated cell sorter (FACS). A: Hoechst 33342; B: Hoechst 33342+ verapamil.

圖1流式細胞儀分析SMMC-7721細胞中的SP細胞

2SP細胞和NSP細胞的體外增殖能力和克隆形成能力

SP細胞和NSP細胞的生長曲線顯示，SP細胞快速增殖至指數增長期，相對而言非SP細胞增殖異常緩慢，在1周時點尚未達到平臺期，見圖2。SP細胞和NSP細胞生長速度差異顯著(n=3,P<0.05)。

Figure 2. Proliferation curves of SP cells and NSP cells.

圖2肝癌SP細胞與NSP細胞生長曲線圖

與NSP細胞相比，SP細胞形成的克隆較密集且直徑較大，見圖3。計算SP細胞的CFE為(35.5±5.6)%，而NSP細胞的CFE為(13.8±4.1)%，二者差異顯著(n=3,P<0.05)。

Figure 3. Colony formation assay of SP cells and NSP cells.

圖3SP細胞和NSP細胞克隆形成能力的比較

3SP細胞和NSP細胞的體外遷移和侵襲能力

Transwell小室遷移和侵襲實驗結果顯示，SP細胞和NSP細胞的遷移和侵襲能力存在明顯差異,見圖4。Transwell小室遷移實驗中SP細胞穿過基底膜的細胞數為(203.6±24.3)個，而NSP細胞僅為(71.5±12.4)個；Transwell小室侵襲實驗中SP細胞穿過基底膜的細胞數為(67.6±9.6)個，而NSP細胞僅為(27.6±10.7)個，兩組比較均差異顯著(n=3,P<0.05)。

4SP細胞和NSP細胞的細胞周期檢測

細胞周期分析結果表明，SP細胞中G0/G1期細胞比例為(64.06%±1.21)%， NSP 細胞中G0/G1期細胞比例為(53.14±1.06)%，SP細胞中處于靜止期的細胞較NSP細胞多，見圖5，差異顯著(n=3,P<0.05)。

Figure 4. Invisive ability of SP cells and NSP cells detected by Transwell invation assay. A: SP cells; B: NSP cells.

圖4Transwell小室侵襲實驗檢測SP細胞和NSP細胞的侵襲能力

5SP細胞和NSP細胞的凋亡率檢測

細胞凋亡分析結果顯示，SP細胞和NSP細胞中Annexin V+細胞比例分別為(15.70±4.92)%和(50.20±7.72)%，兩者差異顯著(n=3,P<0.05)，見圖6。

6裸鼠成瘤實驗結果

1×103數量的SP細胞可在4周后形成明顯的皮下移植瘤。NSP細胞則至少需1×105才能成瘤。

Figure 5. Cell cycle analysis of SP cells and NSP cells. The left panel shows the result of SP cells and the right one exhibit the result of NSP cells.

圖5SP細胞和NSP細胞周期分析結果

Figure 6. Apoptosis detection of SP cells and NSP cells by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI.

圖6AnnexinV-FITC/PI流式細胞儀檢測SP與NSP細胞凋亡

討 論

腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中一小群具有自我更新和無限增殖潛能的細胞，它們可以分化成異質性的腫瘤細胞，是腫瘤形成的根源，也是腫瘤發生轉移、化療耐受、復發的主導因素[4,5]。腫瘤干細胞理論可以更好地解釋腫瘤的生物學特性，也改變了傳統的腫瘤治療觀念。如果找到腫瘤干細胞并以此為治療靶點，可能從根本上治愈腫瘤。目前缺乏特異性的標記物是腫瘤干細胞研究的難題，更多的觀點只是基于現象的理論推測。

Goodell等[6]在用DNA染料Hoechst33342為細胞染色的流式細胞儀分析中發現，有一群細胞染色偏低，與其它大部分細胞不一樣，遂命名為SP細胞。這群細胞對多種染料和藥物具有排斥作用，可能是其細胞表面的ABC轉運載體將Hoechst33342泵出細胞體外的緣故[2]。包括肝癌在內的多種惡性腫瘤組織和腫瘤細胞株都存在SP細胞，提示SP細胞是存在于惡性腫瘤中的一個普遍現象[7-10]。進一步研究發現，從腫瘤細胞中分選出的SP細胞比NSP細胞具有更高的惡性行為，SP細胞可能代表了一群原始的干細胞[11,12]。目前，分選具有干細胞特性的SP細胞已成為多種腫瘤干細胞深入研究的有力工具。本研究利用流式細胞熒光激活分選技術分選肝癌SMMC-7721細胞中的SP細胞和NSP細胞，結果顯示SMMC-7721細胞中SP細胞的比例為(9.2±0.2)%，加入鈣離子通道阻滯劑verapamil后SP細胞比例為(0.0±0.0)%，證明肝癌SMMC-7721細胞中也存在一定比例的SP細胞。

細胞周期分析結果顯示，肝癌SP細胞中處于靜止期的細胞較NSP細胞多，差異顯著。這與Benchaouir等[13]的研究結果一致。他們對SP細胞的細胞周期研究中發現，多數SP細胞是處于G0期的靜止細胞，采用DNA芯片技術對SP細胞的轉錄情況進行分析，發現SP細胞的轉錄能力與主群細胞相比大幅降低，細胞內與細胞周期停滯相關的基因表達上調，而與細胞周期運行的相關基因表達下調，符合干細胞的慢周期特征。抗凋亡是腫瘤干細胞的特性之一，腫瘤組織中大多數腫瘤細胞經過有限增殖和更新后凋亡，而極少數腫瘤干細胞則成為腫瘤生長的“種子”[14]。本研究細胞凋亡結果顯示，肝癌SMMC-7721細胞中的NSP細胞凋亡率顯著高于SP細胞。

細胞生長曲線結果表明，SP細胞生長速度明顯快于NSP細胞；平板克隆實驗顯示SP細胞的克隆形成率高于NSP細胞，且SP細胞形成的克隆較密集且直徑較大。這可能是因為SP細胞中含有更多的干細胞，干細胞分化為祖細胞后增殖速度加快，形成更多更大的克隆。但即便是SP細胞，克隆形成率也只有35.5%左右，這一方面可能因為分選出的SP細胞中只有一部分是肝癌干細胞，另一個原因可能是熒光染料Hoechst 33342的細胞毒性以及分選過程中機械損傷導致細胞在培養過程中死亡。

侵襲轉移是惡性腫瘤的生物學特性之一[15]，腫瘤細胞的異質性同樣表現在這一復雜、多級過程中。在轉移過程中，大約有90%侵入循環系統的轉移細胞可以到達腫瘤轉移灶，有2%的散在細胞可以組成微小轉移，而只有0.02%或是更少的細胞可以發育成血管，形成轉移灶的微環境[16]。從這一現象可以推測參與腫瘤侵襲轉移的可能是腫瘤干細胞。本研究中Transwell小室遷移和侵襲實驗結果顯示，SP細胞48 h穿過人工基底膜的細胞數遠多于NSP細胞，提示SP細胞中可能存在參與腫瘤侵襲轉移的腫瘤干細胞亞群。

裸鼠是細胞免疫缺陷動物，免疫力極低，是干細胞研究較好的實驗動物。我們把分選出的SP細胞移植到裸鼠身上，觀察SP細胞和NSP細胞的致瘤性，結果顯示SP細胞成瘤能力明顯高于NSP細胞。經過1次粗篩的SP細胞只需要1×103個細胞即可成瘤，而NSP細胞成瘤性顯著減弱，但1×105NSP細胞組中也有腫瘤形成，其原因可能是分選的SP細胞亞群并不能代表所有的腫瘤干細胞，也可能是分選出的NSP細胞中可能含有少量的SP細胞。

綜上所述，本研究證實肝癌SMMC-7721細胞中存在SP細胞，而且SP細胞的增殖、克隆形成、抗凋亡、遷移侵襲能力和成瘤能力均高于NSP細胞，SP細胞可能富集了腫瘤干細胞。研究結果將為我們后續針對SP表型治療肝癌提供理論依據。

[1] Burkert J,Wright NA, Alison MR, et al. Stem cells and cancer: an intimate relationship[J]. J Pathol, 2006, 209(3):287-297.

[2] Zhou S, Schuetz JD, Bunting KD, et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype[J]. Nat Med, 2001, 7(9):1028-1034.

[3] Gao Q, Geng L, Kvalheim G, et al. Identification of cancer stem-like side population cells in ovarian cancer cell line OVCAR-3[J]. Ultrastruct Pathol, 2009, 33(4):175-181.

[4] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J]. Nature, 2001, 414(6859):105-111.

[5] Dean M, Fojo T, Bates S. Tumor stem cells and drug resistance[J]. Nat Rev Cancer, 2005, 5(4):275-284.

[6] Goodell MA, Brose K, Paradis G, et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicatinginvivo[J].J Exp Med, 1996,183(4):1797-1806.

[7] Chiba T, Kita K, Zheng YW, et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties[J].Hepatology, 2006,44(1):240-251.

[8] 郭運杰, 崔秀英, 姚和瑞. 乳腺癌細胞株MCF - 7 /ADM中腫瘤干細胞的研究[J].中國病理生理雜志, 2008, 24 (12): 2374-2377.

[9] Fong MY, Kakar SS.The role of cancer stem cells and the side population in epithelial ovarian cancer[J]. Histol Histopathol, 2010, 25(1):113-120.

[10] Wu C, Alman BA. Side population cells in human canc-ers[J]. Cancer Lett, 2008, 268(1):1-9.

[11]Clarke RB. Isolation and characterization of human mammary stem cells[J]. Cell Prolif, 2005,38(6): 375-386.

[12]Henriksen U, Fog JU, Litman T, et al. Identification of intra- and intermolecular disulfide bridges in the multidrug resistance transporter ABCG2[J]. J Biol Chem, 2005,280(44): 36926-36934.

[13]Benchaouir R, Rameau P, Decraene C, et al. Evidence for a resident subset of cells with SP phenotype in the C2C12 myogenic line: a tool to explore muscle stem cell biology[J]. Exp Cell Res, 2004, 294(1): 254-268.

[14]Chen W,Wang G,Lin Y.Apoptosis resistance can be used in screening the markers of cancer stem cells[J].Med Hypotheses, 2006, 67(6):1381-1383.

[15]謝傳高，魏樹梅，陳清宇，等.GEP100基因沉默抑制胰腺癌細胞AsPC-1的侵襲能力[J].中國病理生理雜志,2010,26(7):1348-1351

[16]Luzzi KJ, MacDonald IC, Schmidt EE, et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases[J]. Am J Pathol, 1998, 153(3):865-873.

BiologicalcharacteristicsofsidepopulationcellssortedfromhepatomaSMMC-7721cellline

HUANG Tao1, ZHOU Qi2, GONG Dong-wei3, GAO Quan-li4, ZHANG Xu-hua5, Lü Xiao-dong5, ZHOU Jin-xue1

(1DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,4DepartmentofCancerBiotherapy,5CentralLaboratory,TheAffiliatedTumorHospital,ZhengzhouUniversity,HenanTumorHospital,Zhengzhou450000,China;2DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3DepartmentofGeneralSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;E-mail:hbht68@163.com)

AIM: To study the biological characteristics of side population (SP) cells sorted from hepatoma SMMC-7721 cell line.METHODSFluorescence-activated cell sorter (FACS) was used to sort SP cells and non-SP (NSP) cells from SMMC-7721 cell line. The colony-formation ability and proliferation ability between SP cells and NSP cells were compared in terms of plate colony assay and growth curve. The migratory and invasive properties of SP cells and NSP cells were tested by Transwell method. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. The oncogenicity of the cells was analyzed by nude mouse transplantation tumor experimentinvivo.RESULTSThe results of FACS analysis indicated that (9.2±0.2)% of the SMMC-7721 cells were SP cells. The proportion of G0/G1phase of SP cells was higher, and the apoptotic rate was lower than those of NSP cells (P<0.05). The proliferation ability and colony-forming ability and migratory and invasive properties of SP cells were significantly higher than those of NSP cells (P<0.05). The nude mouse transplantation tumor experiment displayed that the oncogenicity of SP cells was higher than that of NSP cells.CONCLUSIONThe SP cells sorted from SMMC-7721 cell line may enrich tumor stem cells.

Liver neoplasms; Side population cells; Tumor stem cells; SMMC-7721 cells

R735.7

A

1000-4718(2011)03-0523-05

2010-10-20

2010-11-30

河南省科技廳基礎與前沿研究資助項目(No.082300450100)

△通信作者 Tel: 0371-65587025; E-mail: hbht68@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.020