TLR活化參與環(huán)孢素A誘發(fā)的慢性腎小管間質(zhì)損傷

洪英禮, 金英順, 崔鎮(zhèn)花, 陳 瑛, 李 燦

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 延吉 133000)

TLR活化參與環(huán)孢素A誘發(fā)的慢性腎小管間質(zhì)損傷

洪英禮, 金英順, 崔鎮(zhèn)花, 陳 瑛, 李 燦△

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 延吉 133000)

目的探討慢性腎小管間質(zhì)損傷的免疫發(fā)生機(jī)制。方法Sprague-Dawley大鼠皮下注射環(huán)孢素A(CsA,15 mg·kg-1·d-1) 4周建立慢性腎小管間質(zhì)損傷模型，對照組給予皮下注射橄欖油 (1 mL·kg-1·d-1)。檢測兩組大鼠的腎功能；三色染色和免疫組織化學(xué)染色確定腎小管間質(zhì)損傷程度(炎性細(xì)胞浸潤和帶狀纖維化)；熒光原位雜交技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色分別觀察腎內(nèi)Toll樣受體(TLR)、TLR配基-熱休克蛋白70 (HSP70)及補(bǔ)體系統(tǒng)成分(C3、C4d和C9)的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比，腎毒性組表現(xiàn)為腎功能低下、腎間質(zhì)大量ED-1陽性細(xì)胞浸潤、腎小管間質(zhì)帶狀纖維化(P<0.01)。同時，腎毒性組TLR2和TLR4的mRNA 和蛋白水平明顯上調(diào)；TLR 配體 HSP70 免疫活性增加；補(bǔ)體C3、C4d和C9的免疫活性顯著增加。這些高表達(dá)的免疫成份主要位于腎小管間質(zhì)受損部位。結(jié)論激活的腎內(nèi)天然免疫與CsA引起的慢性腎小管間質(zhì)損傷有關(guān)。

腎小管間質(zhì)損傷； 天然免疫； 受體,Toll樣； 熱休克蛋白質(zhì)70； 補(bǔ)體； 環(huán)孢菌素

天然免疫(innate immunity)應(yīng)答是機(jī)體防御感染性疾病的第一防線，天然免疫是由Toll樣受體 (Toll-like receptor, TLR)及其配體所介導(dǎo)[1]。最近研究表明，TLR通過識別不同病原體的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)在抗感染天然免疫中發(fā)揮作用。TLR可對PAMP 進(jìn)行識別，引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)。因此，TLR控制著由天然免疫向獲得性免疫的轉(zhuǎn)變。然而，有關(guān)天然免疫引起腎損傷的報道甚少。

環(huán)孢素A(cyclosporine A, CsA)是一種強(qiáng)有力的免疫抑制劑，但長期使用可引起慢性 CsA 腎毒性，導(dǎo)致移植腎功能延遲(delayed graft function)，限制了其在臨床的使用。研究表明，慢性 CsA 腎毒性以慢性腎小管間質(zhì)損傷為特點(diǎn)，表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)炎癥和帶狀纖維化[2]，其分子機(jī)制尚不完全明確，目前認(rèn)為與炎癥介質(zhì)[3]、轉(zhuǎn)化生長因子β1[4]等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用慢性 CsA 腎毒性動物模型旨在探討：1)是否慢性腎小管間質(zhì)損傷與腎內(nèi)激活的天然免疫系統(tǒng)有關(guān)；2)是否補(bǔ)體系統(tǒng)參與了慢性腎小管間質(zhì)損傷。

材 料 和 方 法

1動物模型

雄性Sprague-Dawley大鼠, 體重220-240 g, 喂食低鹽飲食下(0.05 % sodium, Teklad Premier) 隨機(jī)分成2組：對照組 (n=6)：皮下注射橄欖油 (1 mL·kg-1·d-1, Sigma) 4周；CsA毒性組 (n=8) 皮下注射 CsA (15 mg·kg-1·d-1, Novartis Pharma) 4周。

2腎功能測定

監(jiān)測2組大鼠的體重。處死大鼠前，將大鼠放入代謝籠中(Tecniplast Gazzada)，采血、收集24 h尿,測定血清和24 h尿肌酐, 用以下公式計算肌酐清除率: (24 h尿量×尿肌酐/血清肌酐)/100 g BW。

3腎臟病理

腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(periodate-lysine-paraformaldehyde) 固定, 石蠟包埋后切片(厚4 μm)。脫蠟后行三色(Masson trichrome) 染色,觀察腎小管間質(zhì)纖維化。采用我們以往方法[5]評估腎小管間質(zhì)纖維化程度，利用數(shù)字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows, Olympus)，每張切片上至少觀察20個不同區(qū)域。在100倍顯微鏡下，獲取圖像，利用 Polygon Program定量地計算腎皮質(zhì)受損部位的百分?jǐn)?shù)。由2個觀察者對每個樣本隨機(jī)進(jìn)行盲法評分。

4免疫組織化學(xué)染色

免疫組化步驟如下：石蠟包埋的切片置二甲苯脫蠟和梯度乙醇中脫水, 室溫下 (37 ℃) 0.3% H2O2/甲醛30 min處理后, PBS液洗3次。置微波爐中加熱 5 min行抗原修復(fù) (98 ℃)，PBS 液洗3次。滴加非免疫性血清封閉液, 室溫下進(jìn)行20 min。PBS液洗3次后，在4 ℃下滴加Ⅰ抗孵育12-16 h (ED-1, Serotec Inc.; C3, Santa Cruz Biotechnology; C4d, Quidel Corporation; C9,由Cardiff大學(xué)Dr.B.P.Morgan提供；TLR2, Im-genex; TLR4, Santa Cruz; HSP70, Stressengen)。PBS 液洗3次后滴加Ⅱ抗, 室溫孵育2 h。以DAB為底物顯色, 呈棕黃色為止(具體調(diào)節(jié)時間)。自來水流水洗滌,復(fù)染蘇木素，常規(guī)樹脂封片。數(shù)字化顯微鏡分析儀(Polygon Program)定量地計算抗體染色的百分?jǐn)?shù)和ED-1陽性細(xì)胞計數(shù)。

5TLR2、TLR4的原位雜交(insituhybridization)

利用 DIG RNA 標(biāo)記的試劑盒制備TLR2、TLR4 特異探針，在石蠟包埋的切片按照常規(guī)方法進(jìn)行原位雜交。具體方法如下：二甲苯脫蠟和梯度乙醇中脫水, 室溫下 (37 ℃) 0.3% H2O2/甲醛30 min處理后, PBS液洗3次。置微波爐中加熱5 min行波爐抗原修復(fù) (98 ℃)，PBS 液洗3次。分別置0.2 mol/L鹽酸和1%Triton X-100液中15 min，室溫下與10 mg/L蛋白酶K (Boehringer Mannheim) 浸漬20 min，2×SSC液沖洗后在含有50%除去離子的甲醛、4×SSC、2×Dehardt′s、1 g/L salmon-sperm DNA、1 g/L yeast transfer RNA液中與0.3 mg/L digoxigenin-labeled sense或antisense TLR2、TLR4特異探針過夜進(jìn)行雜交。室溫下切片0.1×SSC沖洗后，雜交過的探針用羊抗-DIG抗體(Fab)結(jié)合堿性磷酸酶標(biāo)記，以NBT/X-磷酸酶(Boehringer Mannheim)顯影。數(shù)字化顯微鏡分析儀(Polygon Program)定量地計算腎皮質(zhì)顯影部位的百分?jǐn)?shù)。

6統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1慢性腎小管間質(zhì)損傷

與對照組相比，在毒性組腎組織中，可以觀察到大量ED-1陽性細(xì)胞浸潤(83±14vs11±2,P<0.01), 見圖1D、表1；還可見腎小管間質(zhì)帶狀纖維化[(25±5)%vs(0±0)%,P<0.01], 見圖1B、表1。同時，腎功能低下，表現(xiàn)為血肌酐的上升[(109.7±12.5)μmoL/Lvs(58.1±2.0)μmoL/L,P<0.01]和肌酐清除率的下降[(0.16±0.03) mL·min-1·100 g-1vs(0.57±0.05) mL·min-1·100 g-1,P<0.01], 見表1。以上結(jié)果表明腎小管間質(zhì)嚴(yán)重受損。

表12組大鼠腎功能及腎小管間質(zhì)損傷程度

Table 1. Renal function and quantitative analysis of tubulointerstitial fibrosis and inflammatory cell infiltration

SCr(μmol/L)CCr(mL·min-1·100g-1)TIF(%)ED-1-positivecellControl(n=6)58．1±2．00．57±0．050±011±2CsA(n=8)109．7±12．5??0．16±0．03??25±5??83±14??

**P<0.01vscontrol group. SCr: serum creatinine; CCr: creatinine clearance rate; TIF: tubulointerstitial fibrosis.

Figure 1. The degree of tubulointerstitial injury detected by Masson trichrome staining (A,B) and immunohistochemistry for ED-1(C，D). A，C: control group; B，D: CsA group.

圖1腎小管間質(zhì)損傷程度

2TLR2mRNA和蛋白的表達(dá)

如圖2所示，正常腎組織中可以觀察到TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)，主要位于腎小管上皮細(xì)胞，而腎間質(zhì)沒有TLR2的表達(dá)。與對照組相比，毒性組大鼠腎TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加，特別是在腎小管間質(zhì)細(xì)胞或浸潤細(xì)胞中高表達(dá)[mRNA：(18±3)%vs(6±2)%；蛋白：(23±5)%vs(6±3)%,P<0.01]。

Figure 2.Insituhybridization (A,B) and immunohistochemistry (C,D) for TLR2 mRNA and protein expression. A,C: control group; B,D: CsA group.

圖2TLR2的RNA原位雜交

3TLR4mRNA和蛋白的表達(dá)

TLR4的表達(dá)情況與TLR2極為相似。與對照組相比，毒性組大鼠腎TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加[mRNA：(27±8)%vs(5±2)%；蛋白：(25±9)%vs(4±2)%,P<0.01]，見圖3B、D。

Figure 3.Insituhybridization (A,B) and immunohistochemistry (C,D) for TLR4 mRNA and protein expression. A,C: control group; B,D: CsA group.

圖3TLR4的RNA原位雜交

4熱休克蛋白70蛋白的表達(dá)

熱休克蛋白70(heat-shock protein 70,HSP70)蛋白被認(rèn)為是天然免疫的配體。免疫組化結(jié)果顯示對照組腎髓質(zhì)正常表達(dá)HSP70，皮質(zhì)可以觀察到少量HSP70蛋白。CsA 4周治療后，腎髓質(zhì)HSP70的表達(dá)不增加，而皮質(zhì)HSP70的免疫活性明顯增加[(75±10)%vs(10±6)%,P<0.01]，見圖4B。

5補(bǔ)體系統(tǒng)成分的表達(dá)

與對照組相比，毒性組補(bǔ)體C3、C4d和C9的免疫活性顯著增加，主要是腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、浸潤細(xì)胞，尤其是在腎小管間質(zhì)受損部位[C3：(38±14)%vs(2±1)%；C4d：(30±3)%vs(5±3)%；C9：(35±11)%vs(9±6)%,P<0.01]，見圖5。

討 論

TLR 是數(shù)年前研究果蠅胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)的背腹側(cè)分化基因(dToll)編碼的一種跨膜受體蛋白。哺乳動物的天然免疫分子Toll樣受體是Toll樣蛋白的同源體，在識別和抵御各種病原微生物中發(fā)揮作用，參與免疫反應(yīng)。目前已被確認(rèn)的成員共有10個[1]。最近學(xué)者發(fā)現(xiàn)，激活的TLR參與了腎缺血再灌注損傷[6]、慢性腎衰竭[7]、急性腎移植排斥反應(yīng)和移植腎功能延遲[8]，給予TLR抑制劑CpG-ODN明顯改善小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎[9]，確定TLR在腎損傷中的作用。本實(shí)驗(yàn)利用RNA原位雜交和免疫組化技術(shù)探討天然免疫系統(tǒng)家族在腎小管間質(zhì)的表達(dá)與分布。結(jié)果表明，對照組腎小管上皮細(xì)胞中僅有少量TLR2和TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)，而在毒性組其表達(dá)明顯上調(diào)，位于近曲、遠(yuǎn)曲腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、浸潤細(xì)胞。有趣的是，這些高表達(dá)主要分布于腎小管間質(zhì)損傷部位。由此，我們推測激活的TLR2和TLR4 參與了CsA所致慢性腎小管間質(zhì)損傷的天然免疫。

Figure 4. Immunohistochemistry for heat-shock protein 70. A: control group; B: CsA group.

圖4熱休克蛋白70的免疫組織化學(xué)染色

Figure 5. Immunohistochemistry for C3 (B), C4d(C)and C9(D). A: control group; B-D: CsA group.

圖5補(bǔ)體系統(tǒng)成分的免疫組織化學(xué)染色

炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)參與了慢性 CsA 腎小管間質(zhì)損傷的過程。因此，受損的腎小管細(xì)胞和降解的細(xì)胞外基質(zhì)可釋放、產(chǎn)生大量的內(nèi)源性物質(zhì)如TLR配體。基于HSP70來源于受損細(xì)胞并參與內(nèi)源性天然免疫調(diào)節(jié)作用[10]，本研究檢測HSP70的表達(dá)。結(jié)果表明，對照組腎皮質(zhì)僅觀察到少量HSP70蛋白，而在毒性組大鼠腎中，HSP70的表達(dá)顯著上調(diào)，主要位于皮質(zhì)、外髓質(zhì)的腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞，該部位正是CsA的損傷靶區(qū)域。綜上所述， HSP70免疫活性增加可能協(xié)同TLR2和TLR4以自分泌或旁分泌方式參與了天然免疫反應(yīng)，導(dǎo)致慢性腎小管間質(zhì)損傷。

補(bǔ)體通過經(jīng)典途徑、甘露糖結(jié)合凝集素途徑(mannan-binding lectin, MBL)或旁路替代途徑被激活，從而參與天然免疫系統(tǒng)。其中，C3參與各種腎臟疾病的發(fā)展。Tang等[11]和Welch等[12]報道C3在正常腎組織中沒有表達(dá)，僅在彌漫性炎癥狀態(tài)下或局灶節(jié)段硬化的腎組織中高表達(dá)。C4d被認(rèn)為抗體介導(dǎo)的慢性移植腎病中排斥反應(yīng)的一種標(biāo)志物[13]，但在其它疾病中如缺血再灌注腎損傷中亦有表達(dá)。C9即膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex, MAC)是補(bǔ)體激活的終末產(chǎn)物，介導(dǎo)慢性腎小管間質(zhì)損傷。本研究利用免疫組化檢測C3、C4d和MAC(C9)在腎內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果表明，C3、C4d和C9的免疫活性明顯增加，與TLR的表達(dá)相似，這些補(bǔ)體成分的高表達(dá)同樣位于腎小管間質(zhì)受損區(qū)域。激活的補(bǔ)體系統(tǒng)參與天然免疫介導(dǎo)的慢性腎小管間質(zhì)損傷。此外，激活的TLR間接地誘導(dǎo)補(bǔ)體產(chǎn)生，因?yàn)門LR4敲除小鼠比野生型小鼠表現(xiàn)為低的C3水平[14]。

綜上所述, 在CsA引起的慢性腎小管間質(zhì)損傷中，CsA激活天然免疫系統(tǒng)導(dǎo)致免疫性腎損傷。本研究結(jié)果為各種非免疫性腎疾病中免疫性腎損傷的機(jī)制研究提供了分子理論基礎(chǔ)。

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ActivatedToll-likereceptorsparticipateinchronicrenaltubulointerstitialinjuryinducedbycyclosporineA

HONG Ying-li, JIN Ying-shun, CUI Zhen-hua, CHEN Ying, LI Can

(NephrologyandDialysisUnit,DepartmentofInternalMedicine,YanbianUniversityHospital,Yanji133000,China.E-mail:canlimd@yahoo.com)

AIM: To study the role of innate immunity in the pathogenesis of renal tubulointerstitial injury.METHODSThe model of nephrotoxic nephropathy was induced by chronic cyclosporine A (CsA) administration (15 mg·kg-1·d-1for 4 weeks) in Sprague-Dawley rats. The tubulointerstitial injury, characterized by inflammatory cell infiltration and striped fibrosis, was examined by the methods of immunohistochemistry and trichrome staining. The expression of Toll-like receptors (TLR), TLR ligand heat-shock protein 70 (HSP70)and intrarenal complement elements (C3, C4d and C9) was evaluated in rat kidneys by the methods ofinsituhybridization and immunohistochemistry.RESULTSCompared with the normal rats, the rats exposed to CsA showed impaired renal function, ED-1-positive cell infiltration and striped tubulointerstitial fibrosis (allP<0.01). Concomitantly, CsA treatment up-regulated the expression of TLR2 and TLR4 at mRNA and protein levels in renal tubular cells, accompanied by increased putative TLR ligand (HSP70) and the immunoreactivity of intrarenal complements. These up-regulated innate immunity components were located in the areas of severe tubulinterstitial injury.CONCLUSIONCsA-induced renal tubulointerstitial injury is closely associated with the activation of intrarenal innate immunity.

Tubulointestitial injury; Innate immunity; Receptors,Toll-like; Heat-shock proteins 70; Complement; Cyclosporine

R363

A

1000-4718(2011)03-0555-05

2010-03-15

2010-12-02

△通訊作者Tel：0433-2660799; E-mail: canlimd@yahoo.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.026