心臟復極儲備電流IKs在糖尿病QT間期延長性別差異中的作用*

王 冰， 曹顏秀， 洪 遠， 張佳琳， 趙 梅， 李雪連,2， 單宏麗,2△

(哈爾濱醫科大學1藥理學教研室， 2 省部共建生物醫藥國家重點實驗室， 黑龍江 哈爾濱 150081)

心臟復極儲備電流IKs在糖尿病QT間期延長性別差異中的作用*

王 冰1， 曹顏秀1， 洪 遠1， 張佳琳1， 趙 梅1， 李雪連1,2， 單宏麗1,2△

(哈爾濱醫科大學1藥理學教研室，2省部共建生物醫藥國家重點實驗室， 黑龍江 哈爾濱 150081)

目的觀察不同性別糖尿病家兔QT間期延長病理條件下的緩慢延遲整流鉀電流(IKs)以及蛋白變化，為探討糖尿病性長QT綜合征性別差異的離子機制做基礎。方法取體重2-2.5 kg家兔，一次性注射預熱(37 ℃)的四氧嘧啶(140 mg/kg)，8周后造成1型糖尿病模型，測定血糖，記錄標準II導聯心電圖，采用酶解法分離家兔單個心室肌細胞，應用全細胞膜片鉗技術記錄動作電位時程(APD)和IKs，并且運用Western blotting法檢測KvLQT1和mink蛋白表達變化。結果雌雄糖尿病組QT間期和APD均較對照組延長，雄性延長明顯，且延長百分比差異顯著(P<0.05)。在+40 mV到+70 mV測試電壓范圍內，雄性糖尿病組IKsstep電流密度均低于對照組(P<0.05)，在+70 mV時，由對照組(3.08±0.67)pA/pF(n=17)降低到(1.27±0.20)pA/pF(n=16)，在0 mV～+70 mV測試電壓范圍內，雌性糖尿病組IKsstep電流密度均高于對照組(P<0.05)，在+70 mV時，由對照組的(1.56±0.20)pA/pF(n=13)增加到(3.65±0.50)pA/pF(n=14)。Western blotting結果顯示雄性糖尿病組KvLQT1和mink蛋白表達水平分別下調21.6%和18.5%；雌性糖尿病組KvLQT1和mink蛋白表達水平分別上調42.3%和20.5%(P<0.05)。結論IKs參與了糖尿病QT間期延長的發生，并且存在性別差異。在雌性家兔早期糖尿病模型中，作為一個復極儲備，代償性上調，限制了QT間期的過度延長。

糖尿?。?QT間期延長； 緩慢延遲整流鉀電流； 膜片鉗術

心血管并發癥是糖尿病病人死亡的主要原因[1]，其中長QT綜合征(long-QT syndrome，LQTS)的發生同病人心性猝死的危險性呈正相關[2,3]，并且存在顯著性別差異[4]，但其具體機制研究尚少。家兔心臟存在快速延遲整流鉀電流(rapid delayed rectifier potassium current，IKr)和緩慢延遲整流鉀電流(slow delayed rectifier potassium current，IKs)，這些電流在大鼠和小鼠中是缺失的，而在許多物種如人類和兔IKr是心肌細胞的主要復極電流[5]。糖尿病模型中QT間期和動作電位時程(action potential duration，APD)的延長主要是IKr異常所致[5-7]。當某些因素抑制了復極化電流如IKr時，IKs的作用就凸顯出來了，其具有緩慢激活的動力學特性，可作為一個復極儲備，限制APD的過度延長[8]。而當這個安全因子被抑制后，可導致更明顯的QT間期延長[9]。然而IKs的這種保護機制往往被忽略了，它在糖尿病家兔QT間期延長的性別差異中是否發揮作用也尚不清楚。因此，本實驗探討了不同性別糖尿病家兔QT間期延長時IKs電流以及蛋白表達的變化，為探討糖尿病性長QT綜合征性別差異的離子機制做基礎。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 健康成年雌雄家兔，體重2-2.5 kg，由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供。

1.2藥品和試劑 HEPES、EGTA、Na-ATP、小牛血清蛋白(BSA)、膠原酶Ⅱ和4-AP均購自Sigma;其余試劑均為國產分析純。KvLQT1、mink抗體購于Santa Cruz;紅外熒光標記的Ⅱ抗(Alexa Fluor 700)購自Molecular Probes。

1.3溶液 液體成分(mmol·L-1)：(1)臺氏液:NaCl 126， KCl 5.4，MgCl21.0，CaCl211.8，NaH2PO40.33，glucose 10，HEPES 10，NaOH調pH至7.4；(2)細胞保存液:glutamic acid 70，taurine 15，KCl 30，KH2PO410，MgCl215，EGTA 15，HEPES 10，glucose 10，1% albumin，KOH調節pH至7.4；(3)電極內液：KC1 20，天門冬氨酸 110，KOH 110，HEPES 5，MgCl2·6H2O 1，EGTA 4，Na2-ATP 5，KOH調節pH至7.2。

2方法

2.1家兔糖尿病模型的建立 正常雄雌家兔，體重2-2.5 kg，隨機分為雄性對照組、雄性糖尿病組、雌性對照組、雌性糖尿病組。糖尿病造模采用1次耳緣靜脈注射預熱的(37 ℃)四氧嘧啶(140 mg/kg，溶于生理鹽水中)。為避免由胰島素大量釋放而引起的致死性低血糖，四氧嘧啶處理后4 h和6 h均給予10%葡萄糖溶液(100 mg/kg，皮下注射)[10]。

2.2評價糖尿病和QT間期延長的標準 在四氧嘧啶注射前和注射后的每周，測定血糖水平，高于15 mmol/L認為造模成功。造模后8周利用BL-420E+生物機能實驗系統記錄Ⅱ導聯心電圖。依據QT間期及RR間期，使用Carlsson公式計算校正的QT間期(QTc)[QTc=QT-0.175(RR-300)]。

2.3家兔心室肌細胞的分離[10]家兔麻醉后，開胸迅速取出心臟，將其連于Langendorf灌流器(恒溫，37 ℃)上，以正常臺氏液約8 mL/min 連續灌流5 min，洗去心臟殘血，然后用無鈣臺氏液灌流約10 min至心臟停搏，換含Ⅱ型膠原酶(10 mg/50 mL)的無鈣液循環灌流心臟，當心臟變軟變大，顏色變淺開始取心臟組織，每隔2 min取1次。將不同時間取下的心肌組織放于裝有細胞保存液的試管中，用吸管輕輕吹打，使之分散成單個細胞，取出大塊組織，置于4 ℃冰箱穩定1 h待用。

2.4全細胞膜片鉗技術 實驗過程將遵照我們以往建立的方法[11,12]。Axopatch-200B放大器在電壓鉗模式下記錄電流，在電流鉗模式下記錄單細胞動作電位。酸硼玻璃電極充灌電極內液后尖端電阻1MΩ-3MΩ。向Olympus IX-70型倒置顯微鏡上方的浴槽內滴入1滴細胞懸液，放置10 min左右，待細胞貼壁后用臺氏液持續灌流，沖洗細胞。選擇貼壁良好、橫紋清晰、胞膜完整、折光率好的細胞進行實驗。為記錄IKs電流，在浴液中加入TTX(1 μmol/L)阻斷INa，尼索地平(1 μmol/L)阻斷ICa-L，4-氨基吡啶(1 mmol/L)阻斷Ito，多菲菜德(1 μmol/L)阻斷IKr。實驗過程由計算機軟件pCLAMP 9.2控制數-模轉換器完成刺激信號的產生、反饋信號的采集和數據分析。形成高阻封接后,抽吸破膜,形成全細胞模式,在電壓鉗和電流鉗的模式下進行刺激和記錄。

2.5免疫印跡 超速離心法提取各組家兔心室肌細胞膜蛋白，BCA法進行定量，用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉印到PVDF膜上，封閉。KvLQT1和mink的多克隆抗體4 ℃孵育過夜。第2 d PBS緩沖液洗膜后用稀釋的紅外熒光標記Ⅱ抗對膜避光孵育1 h，用PBS緩沖液洗膜3次,每次10 min。最后Odyssey紅外熒光掃描成像系統(LI-COR)對膜上蛋白質進行檢測。各組的免疫印跡結果應用Quantity One軟件檢測條帶密度(面積×A值)，并以GAPDH進行標準化。

3統計學處理

結 果

1糖尿病家兔血糖變化

糖尿病組家兔血糖水平較對照組呈明顯上升趨勢。靜脈注射四氧嘧啶后8周內，雄性家兔血糖由(5.91±0.69)mmol/L上升至(18.40±2.04)mmol/L，雌性家兔血糖由(5.61±0.38)mmol/L上升至(21.40±2.81)mmol/L,見圖1。

圖1不同性別家兔注射四氧嘧啶后的血糖變化

2糖尿病家兔心電圖參數變化

糖尿病組家兔QTc均高于對照組，差異顯著。雄性糖尿病QTc較對照組延長了18.9%，雌性糖尿病組QTc較對照組延長了16.3%，雄性延長明顯，且延長百分比差異顯著(P<0.05),見圖2。

3糖尿病家兔心肌細胞動作電位變化

應用全細胞膜片鉗技術，記錄單個細胞的動作電位，細胞封接阻抗為10 GΩ以上，保持電壓為-80 mV。結果顯示, 在正常細胞外液(pH7.4)條件下，雌雄糖尿病組APD較對照組均延長，且雄性糖尿病組APD50由(271.50±32.34)ms增加到(556.64±72.47)ms；APD90由(347.81±36.27)ms增加到(647.92±72.15)ms。雌性糖尿病組APD50由(279.90±27.58)ms增加到(403.80±53.25)ms；APD90由(376.60±38.61)ms增加到(540.50±48.51)ms。雄性延長明顯，且延長百分比差異顯著(P< 0.05)，見圖3。

圖2不同性別糖尿病家兔校正QT間期

圖3不同性別糖尿病家兔心室肌細胞的動作電位

4糖尿病家兔心肌細胞IKs電流變化

形成全細胞構型后，將保持電壓固定在-50 mV，實驗電壓從-40 mV，以10 mV為步階階躍至+70 mV，測定脈沖末期2.5 s時的電流。應用IKr阻斷劑多菲菜德(1 μmol/L),結果表明，在+40 mV到+70 mV測試電壓范圍，雄性糖尿病組心肌細胞IKsstep電流密度均低于對照組，在+70 mV時，由對照組(3.08±0.67)pA/pF降低到(1.27±0.20)pA/pF(n=16，P< 0.05)；而在0 mV到+70 mV測試電壓范圍內，雌性糖尿病組心肌細胞IKsstep電流密度均高于對照組，在+70 mV時，由對照組的(1.56±0.20)pA/pF增加到(3.65±0.50)pA/pF(n=14，P< 0.05),見圖4。

圖4不同性別糖尿病家兔IKs電流變化

5糖尿病家兔心肌KvLQT1和mink蛋白表達水平

Western blotting檢測結果顯示，雄性糖尿病組IKs通道亞基KvLQT1和mink表達水平較對照組分別下調了21.6%和18.5%；雌性糖尿病組IKs通道亞基KvLQT1和mink表達水平較對照組分別上調了42.3%和20.5%(n=6，P< 0.05),見圖5。

圖5不同性別糖尿病家兔IKs蛋白水平的變化

討 論

本實驗研究了IKs在糖尿病QT間期延長性別差異中的作用。結果顯示，在1型糖尿病家兔模型中，雌雄糖尿病組QT間期和APD均較對照組延長，雄性糖尿病組延長明顯，且延長百分比差異顯著。隨后我們應用全細胞膜片鉗技術觀察到雄性糖尿病組IKs電流密度低于對照組，而雌性糖尿病組IKs電流密度高于對照組；Western blotting結果顯示雄性糖尿病組KvLQT1和mink表達下調；雌性糖尿病組KvLQT1和mink表達上調，蛋白表達水平與電流變化相一致。這種截然相反的變化說明IKs電流的確參與了糖尿病QT間期延長性別差異的發生。

糖尿病是臨床常見病、多發病，而心血管并發癥是糖尿病人死亡的主要原因[13]。其中以LQTS最為多見，是導致糖尿病患者心性猝死的重要原因之一。QT間期反映的是心室除極和復極的整個時期或細胞APD。APD由細胞內、外向電流之間的精細平衡所控制，內向電流的增加和/或外向電流的減少都會延長APD及QT間期，APD的過度延長是糖尿病心肌細胞的特征性改變。在許多物種如人類和兔的心臟中存在IKr和IKs電流，它們共同參與心肌細胞的復極過程，其降低均會導致APD/QT間期的延長，而這些電流在大鼠和小鼠中是缺失的。我們的研究發現雌雄糖尿病家兔均出現了QT間期和APD延長，這主要是由于繼發于代謝紊亂的一些細胞變化引起IKr異常所致[7,14]。在隨后的性別差異研究中發現，雌雄糖尿病組APD/QT間期延長的百分比存在差異，雄性延長明顯。在兔模型中，心肌細胞的IKr雄性大于雌性[15]，同樣，在豚鼠中也觀察到類似的IKr性別差異[8]。這種低IKr密度說明健康女性具有更長的基礎QT間期，為臨床上女性糖尿病患者較男性糖尿病患者擁有較高的QT間期延長發生率提供了理論基礎。糖尿病QT間期延長主要由于IKr異常使APD延長進而引起LQTS，雄性家兔擁有更多可以利用的IKr，結果應該是雌性家兔APD延長更加明顯，必然是除了IKr有其它電流的參與。雖然在生理條件下IKs的作用是有限的，但是其緩慢激活的動力學特性可作為一個復極儲備，限制APD的過度延長[8]。IKs通道蛋白由KCNQ1基因編碼的α亞基(KvLQT1)及KCNE1基因編碼β亞基(mink)構成，通道蛋白表達的變化可以直接影響相應電流的改變。在我們的實驗中雄性糖尿病組IKs電流密度及蛋白表達水平均較對照組降低，與雄性結果相反，雌性糖尿病組IKs電流密度及蛋白表達水平均較對照組升高?？梢姶菩蕴悄虿〗MIKs電流代償性增大，它作為一個復極儲備，限制了復極過慢，使得雌性糖尿病組APD沒有雄性延長明顯。綜上所述，在家兔1型糖尿病模型中，IKs確實參與了糖尿病QT間期延長性別差異的發生，并且它的作用不容忽視，尤其是在某些因素抑制了其它復極電流時，IKs的作用就凸顯出來。

[1] 謝中全.糖尿病心臟病及其防治進展[J].中國醫藥指南,2009,7(2):15-16.

[2] Whitsel EA, Boyko EJ, Rautaharju PM, et al. Electrocardiographic QT interval prolongation and risk of primary cardiac arrest in diabetic patients [J]. Diabetes Care, 2005, 28(8):2045-2047.

[3] Suys BE, Huybrechts SJ, De Wolf D, et al. QTc interval prolongation and QTc dispersion in children and adolescents with type 1 diabetes [J]. J Pediatr, 2002, 141(1):59-63.

[4] Sugden PH, Clerk A. Akt like a woman: gender differences in susceptibility to cardiovascular disease [J]. Circ Res, 2001, 88(10): 975-977.

[5] Lu Z, Kamiya K, Opthof T,et al. Density and kinetics ofIKrandIKsin guinea pig and rabbit ventricular myocytes explain different efficacy ofIKsblockade at high heart rate in guinea pig and rabbit: implications for arrhythmogenesis in humans [J]. Circulation, 2001, 104(8):951-956.

[6] Zhang Y, Han H, Wang J, et al. Impairment of human ether--go-go-related gene(HERG) K+channel function by hypoglycemia and hyperglycemia. Similar phenotypes but different mechanisms [J]. J Biol Chem, 2003, 278(12): 10417-10426.

[7] Wang J, Wang H, Zhang Y, et al. Impairment of HERG K+channel function by tumor necrosis factor-α: role of reactive oxygen species as a mediator [J]. J Biol Chem, 2004, 279(14):13289-13292.

[8] Jost N, Virág L, Bitay M, et al. Restricting excessive cardiac action potential and QT prolongation: a vital role forIKsin human ventricular muscle [J].Circulation, 2005, 112(10):1392-1399.

[9] Xiao L, Xiao J, Luo X, et al. Feedback remodeling of cardiac potassium current expression: a novel potential mechanism for control of repolarization reserve [J]. Circulation, 2008, 118(10):983-992.

[10]Zhang Y, Xiao J, Lin H, et al. Ionic mechanisms underlying abnormal QT prolongation and the associated arrhythmias in diabetic rabbits: a role of rapid delayed rectifier K+current [J]. Cell Physiol Biochem, 2007, 19(5-6):225-238.

[11]許超謙，董德利，杜志敏，等. 苦參堿、小檗胺與胺碘酮、RP58866抗心律失常作用的比較[J]. 藥學學報,2004,39(9):691-694.

[12]Yang B, Lin H, Xu C, et al. Choline produces cytoprotective effects against ischemic myocardial injuries: evidence for the role of cardiac M3subtype muscarinic acetylchline receptors [J]. Cell Physiol Biochem, 2005, 16(4-6): 163-174.

[13]宋光遠，王喜梅，楊躍進,等. STZ誘導的糖尿病大鼠急性心肌梗死后心臟重構及相關基因的表達[J].中國病理生理雜志，2009，25(12)：2302-2309.

[14]Ceylan-Isik AF，Lacour KH，Ren J. Gender disparity of streptozotocin-induced intrinsic contractile dysfunction in murine ventricular myocytes: role of chronic activation of Akt [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2006, 33(1-2):102-108.

[15]Liu XK, Katchman A, Whitfield BH, et al.Invivoandrogen treatment shortens the QT interval and increases the densities of inward and delayed rectifier potassium currents in orchiectomized male rabbits [J]. Cardiovasc Res, 2003, 57(1):28-36.

CardiacIKsasrepolarizationreserveplaysaroleingenderdifferenceofdiabeticQTprolongation

WANG Bing1, CAO Yan-xiu1, HONG Yuan1, ZHANG Jia-lin1, ZHAO Mei1, LI Xue-lian1,2, SHAN Hong-li1,2

(1DepartmentofPharmacology，2TheState-ProvinceKeyLaboratoriesofBiomedicine-PharmaceuticsofChina,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China.E-mail:shanhongli@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the basic ionic mechanisms underlying long-QT syndrome by observing the changes of slowly activating outward rectifying potassium current (IKs) and its proteins in abnormal QT prolongation in different genders of diabetic rabbits.METHODSA single injection of pre-warmed (37 ℃) alloxan (140 mg/kg) was used to establish a rabbit model of insulin-dependent diabetes mellitus. Eight weeks after alloxan injection, the levels of blood glucose in the rabbits were monitored and standard lead II electrocardiogram was recorded. The myocardial cells were isolated from the ventricle of the rabbits via enzymatic digestion. Whole-cell patch clamp technique was performed to study the action potential duration (APD) andIKs. The changes of both KvLQT1 and mink proteins were detected by Western blotting analysis.RESULTSThe QT interval and APD were prolonged apparently both in male and female diabetic rabbits. The increased APD/QT-I of the male diabetic rabbits is more remarkable than that of the female. TheIKsstep current density of the male diabetic rabbits was decreased at test potentials ranging from+40 mV to+70 mV compared with that of the control animals (P<0.05), which was lowered from (3.08±0.67) pA/pF (n=17) to (1.27±0.20) pA/pF (n=16) at+70 mV. However, theIKsstep current density of the female diabetic rabbits was increased at test potentials ranging from 0 mV to+70 mV compared with that of control group (P<0.05), which was increased from (1.56±0.20) pA/pF (n=13) to (3.65±0.50) pA/PF (n=14) at+70 mV. The expression of KvLQT1 and mink in male diabetic group decreased by 21.6% and 18.5%, respectively. However, the expression of KvLQT1 and mink in female diabetic group were increased by 42.3% and 20.5%, respectively.CONCLUSIONTheIKsmay be a protective factor in the early period of diabetic development in female rabbits. As a repolarization reserve, cardiacIKsis likely to restrict the effects of excessively slowing repolarization.

Diabetes mellitus; QT interval prolongation; Slow delayed rectifier potassium current; Patch-clamp techniques

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.024

1000-4718(2011)01-0124-05

2010-07-09

2010-11-10

國家自然科學基金資助項目(No.30600253)；教育部重點資助項目(No.207031)；黑龍江省留學歸國人員基金資助項目(No.LC07C10)

△通訊作者 Tel: 0451-86671354； E-mail: shanhongli@yahoo.com.cn