植物乳酸菌類細(xì)菌素特性研究及其產(chǎn)生條件的優(yōu)化

解俊梅，文 漢

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036)

植物乳酸菌類細(xì)菌素特性研究及其產(chǎn)生條件的優(yōu)化

解俊梅，文 漢*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036)

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了乳酸菌產(chǎn)乳酸菌素的培養(yǎng)條件并分析了其特性。結(jié)果表明:植物性乳酸桿菌生長的最佳培養(yǎng)條件組合是溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH為6.0，接種量4%，種齡12h，厭氧條件下，培養(yǎng)時(shí)間40h;乳酸菌菌素對(duì)革蘭氏陰性菌和酵母菌的抑菌作用最大的最佳培養(yǎng)條件組合是溫度28℃，培養(yǎng)基初始pH為7.0，接種量2%，種齡10h，厭氧條件下，培養(yǎng)時(shí)間24h。乳酸菌菌素革蘭氏陽性菌的抑菌作用最大的最佳培養(yǎng)條件組合是溫度28℃，培養(yǎng)基初始pH為6.5，接種量1%，種齡6h，厭氧條件下，培養(yǎng)時(shí)間40h。在排除酸性產(chǎn)物和過氧化氫的干擾后，該乳酸菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌等革蘭氏陰性菌具有較好的抑制作用，而且對(duì)部分真菌也有抑制作用;經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后發(fā)酵液抑菌活性略有下降，表明乳酸菌素為非蛋白成分或起抑菌作用的非單一物質(zhì)。它具有很好的熱穩(wěn)定性，在酸性條件下穩(wěn)定且活性高，對(duì)蛋白酶敏感性低，且具有較廣的抑菌譜。

發(fā)酵條件優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)，指示菌，類細(xì)菌素

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一群桿狀或球狀的革蘭氏陽性細(xì)菌。最新的研究資料表明，已報(bào)道的乳酸菌有23個(gè)屬，廣泛存在于人和動(dòng)物的腸道和其他與外界相通的生理環(huán)境中，許多食品、飼料，以及自然界的許多物料中也有乳酸菌的存在［1］。乳酸菌產(chǎn)生具有抑菌或殺菌效果的有機(jī)酸、過氧化氫、雙乙酰和細(xì)菌素。細(xì)菌素(bacterioicin)是某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性的肽類或蛋白質(zhì)，一般只對(duì)親緣關(guān)系較近的細(xì)菌有毒害作用，而對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌無效。如乳酸菌素(LAB of Bacteriocins)中nisin被公認(rèn)為安全且是唯一被批準(zhǔn)使用的食品生物防腐劑，在乳制品及罐頭制品中得到了廣泛的應(yīng)用［2］。但是，后來的很多研究表明，乳酸菌產(chǎn)生很多類似細(xì)菌素混合物，這些混合物能夠廣泛地抑制病原菌和腐敗菌。人們把陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的一些不符合或不完全符合細(xì)菌素定義的拮抗物質(zhì)，稱為類細(xì)菌素(bacteriocin－like substance)。類細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌等都具有抑制作用，因此應(yīng)用前景更為廣泛。盡管有人認(rèn)為在發(fā)酵食品和活菌制劑中直接使用產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌比添加細(xì)菌素更加節(jié)約成本，但隨著國內(nèi)市場的發(fā)展，作為極具潛力的生物防腐劑的細(xì)菌素倘若作為保健品或更高級(jí)別的產(chǎn)品的功效成分出現(xiàn)，對(duì)其加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，包括進(jìn)行提取、純化及結(jié)構(gòu)鑒定是必要的。國外對(duì)許多細(xì)菌素的研究都包括了提取、純化和結(jié)構(gòu)鑒定等方面的工作。本研究運(yùn)用牛津杯擴(kuò)散法作為檢測方法，對(duì)乳酸菌所產(chǎn)的具有廣譜抑菌活性物質(zhì)的特性及產(chǎn)生條件進(jìn)行了研究，以期為其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物乳酸菌(Lactobacillus plantrum)、酵母菌(yeast)、大腸桿菌(Escherichia coli)、雞白痢沙門氏菌(Salmonella typhimunius)及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach) 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;胰蛋白酶、過氧化氫酶 AMRESCO公司;胃蛋白酶 BIOSHARP公司;木瓜蛋白酶;MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 指示菌菌懸液的制備 參考文獻(xiàn)［2］的方法。

1.2.2 發(fā)酵液的制備 參考文獻(xiàn)［3］的方法。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)［2，7］取發(fā)酵液150μL，按文獻(xiàn)［2，7］進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 乳酸菌生長曲線的制作［4］將收集的每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間下的發(fā)酵液，pH調(diào)至4.0做抑菌實(shí)驗(yàn)，測定抑菌圈直徑。

1.2.5 發(fā)酵液的抑菌譜測定［2］以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、雞白痢沙門氏菌和兩種不同的大腸桿菌及酵母菌、黑曲霉菌為指示菌，牛津杯雙層培養(yǎng)基法做抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)［4］a.培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響∶分別將接種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基置于不同的溫度(27、30、37、42℃)下培養(yǎng)48h，測定菌體生長，做抑菌實(shí)驗(yàn)測定抑菌圈直徑。

b.培養(yǎng)基初始pH對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響∶將MRS液體培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0接種，37℃培養(yǎng)48h，測定菌體生長，做抑菌實(shí)驗(yàn)測定抑菌圈直徑。

c.培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響∶分別以l%的接種量接種數(shù)支于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，在不同時(shí)間(0～68h)取樣，測OD值和pH，做抑菌實(shí)驗(yàn)測定抑菌圈直徑。

d.接種量對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響∶分別以0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，測定菌體生長，做抑菌實(shí)驗(yàn)測定抑菌圈直徑。

e.種齡對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響∶分別將6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h的不同種齡的乳酸菌種子接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，測定菌體生長，做抑菌實(shí)驗(yàn)測定抑菌圈直徑。

f.供氧量對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響∶有氧培養(yǎng)∶以1%接種量接種于紗布塞的三角瓶中37℃培養(yǎng)48h;厭氧培養(yǎng)∶以l%接種量于Ep管中37℃培養(yǎng)48h。測定菌體生長。

1.2.6.2 正交實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)條件的最佳組合 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了最佳培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、最佳接種量、最佳種齡、最佳培養(yǎng)時(shí)間、最佳供氧條件。為了進(jìn)一步確定最佳培養(yǎng)條件的組合，取五種影響因子培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、接種量、種齡、培養(yǎng)時(shí)間，各因子各取4個(gè)水平。因素水平表見表1，采用L16(45)正交表安排實(shí)驗(yàn)［4］。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.6.3 抑菌實(shí)驗(yàn) 同1.2.3。

1.2.7 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的特性的研究［2－5］

1.2.7.1 溫度對(duì)發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)效價(jià)的影響 將發(fā)酵液分兩組，一組在121℃高壓鍋內(nèi)處理20min，另一組不經(jīng)過高溫濕熱處理，分別加入1號(hào)、2號(hào)牛津杯中，分別以大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌作為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.7.2 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液上清抑菌效價(jià)的影響［8］將發(fā)酵液分成4管，其中三管分別加入胃蛋白酶

(3mg/mL)、木瓜蛋白酶(3mg/mL)，胰蛋白酶(3mg/mL)，3管同時(shí)在37℃下水浴2h，以未處理的發(fā)酵液和同相應(yīng)酶終濃度的無菌水溶液作對(duì)照，處理后樣液的pH調(diào)至原發(fā)酵液的pH。再分別以枯草芽孢桿菌等活菌為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.7.3 發(fā)酵液抑菌物質(zhì)中過氧化氫干擾的排除取乳酸菌發(fā)酵液2mL，加過氧化氫酶到終濃度為15mg/mL，37℃處理2h，以未處理的發(fā)酵液和同過氧化氫酶濃度的無菌水溶液作對(duì)照，處理后樣液的pH調(diào)至原發(fā)酵液的pH，分別以枯草芽孢桿菌等活菌為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.7.4 酸對(duì)發(fā)酵液抑菌效價(jià)的影響 用pH計(jì)測量發(fā)酵液的pH為3.75，分別配制pH為3.75的鹽酸和乳酸，利用牛津杯雙層培養(yǎng)基平板法測定發(fā)酵液及鹽酸和乳酸的抑菌活性。

1.2.7.5 觀察不同pH對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 用1mol/L的乳酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液上清的pH，使上清的pH分別為3.0、4.0、4.5、5.0、6.0，以枯草芽孢桿菌等活菌為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

表2 乳酸菌發(fā)酵液的抑菌譜(±s)，n=3

表2 乳酸菌發(fā)酵液的抑菌譜(±s)，n=3

指示菌 大腸桿菌1 大腸桿菌2 雞白痢沙門氏菌金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌 酵母菌 黑曲霉抑菌圈直徑(mm) 28.5±0.71 21.0±1.87 23.7±0.82 25.8±2.16 25.8±0.41 28.8±0.32 0

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線

圖1顯示，乳酸菌菌株在培養(yǎng)2h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，8h以后進(jìn)入穩(wěn)定期并一直持續(xù)下去，在30～38h，菌數(shù)有波動(dòng)，38h后菌數(shù)又趨于穩(wěn)定。圖上未見明顯的延滯期和衰亡期。

細(xì)菌的生長過程中，各個(gè)時(shí)期的長短取決于菌種特性和培養(yǎng)條件。延滯期長短取決于菌種遺傳性狀、種齡、接種前后培養(yǎng)條件的差異等，自幾分鐘到數(shù)小時(shí)不等。圖中未見明顯的延滯期是因?yàn)榇巳樗峋杲臃N后的培養(yǎng)條件與之前進(jìn)行活化的培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基，縮短或消除了延滯期，還可能是因?yàn)榻臃N的菌株種齡處于對(duì)數(shù)生長期，大大縮短了菌株適應(yīng)新環(huán)境的時(shí)間。2～8h是該乳酸菌菌株生長的對(duì)數(shù)期。8h以后進(jìn)入穩(wěn)定期，由圖1可以看出，該菌株穩(wěn)定期時(shí)間較長。圖中未見明顯衰亡期可能是因?yàn)樵谌拥?8h內(nèi)培養(yǎng)基營養(yǎng)還未耗盡，菌株生長速率與死亡率仍平衡。30～38h內(nèi)菌數(shù)有波動(dòng)可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基性質(zhì)變化所致。

2.2 抑菌譜的測定

從表2中數(shù)據(jù)可知，乳酸菌發(fā)酵液即對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌，革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌及真菌有明顯的抑菌作用。從而得知，乳酸菌發(fā)酵液有廣泛的抑菌譜。

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響 由圖1可知，抑菌物質(zhì)在2h時(shí)開始產(chǎn)生，在對(duì)數(shù)生長期抑菌物質(zhì)產(chǎn)量持續(xù)增加，但在進(jìn)入穩(wěn)定期后產(chǎn)量卻沒有明顯增加，而呈上下波動(dòng)。發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性在2～6h內(nèi)持續(xù)增加，在20h達(dá)到第一個(gè)極大值(28.5mm)，后又急速減小，但從培養(yǎng)時(shí)間上看，對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的影響不同，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈在16h有個(gè)快速下降，而對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈在22h有個(gè)快速下降，而后它們再波動(dòng)著上升，至抑菌圈大小出現(xiàn)了最大值 31.17mm和32.17mm后再下降。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)培養(yǎng)過程中抑菌作用的影響

這可能是由于穩(wěn)定期的細(xì)胞體積變小，培養(yǎng)基性質(zhì)如pH發(fā)生較大變化，而使抑菌物質(zhì)產(chǎn)量上下波動(dòng)。還可知，抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生在對(duì)數(shù)期內(nèi)隨著細(xì)胞數(shù)量的增長而增長，進(jìn)入穩(wěn)定期后并不是趨于穩(wěn)定，而是一直在變化。另外，由圖可知，發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性24～42h內(nèi)持續(xù)增加，而對(duì)B.S的抑菌活性卻上下波動(dòng)，由此可知此乳酸菌菌株在同一時(shí)間產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌和枯草桿菌的抑菌活性變化并不一致，這可能是由于抑菌物質(zhì)對(duì)這兩種細(xì)菌的抑菌機(jī)制不同，仍需繼續(xù)研究。

抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生在進(jìn)入穩(wěn)定期后上下波動(dòng)，可能是由于抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生是乳酸菌菌株的一種應(yīng)激調(diào)節(jié)，是細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的一種應(yīng)激反應(yīng)。另外，也有可能是抑菌物質(zhì)的合成受分解代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物的阻遏抑制，由于胞外代謝產(chǎn)物的累積使得抑菌物質(zhì)的進(jìn)一步合成受到抑制，而當(dāng)分泌到培養(yǎng)基內(nèi)的抑菌物質(zhì)分解失活導(dǎo)致產(chǎn)量下降又進(jìn)一步促使抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響 由圖2可以看出，此乳酸菌菌株最適生長pH為6.0。在pH為7.5條件下產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性最大。在其他條件下，細(xì)菌素產(chǎn)量雖有波動(dòng)，但抑菌活性都很大，說明此乳酸菌菌株的抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生有較寬的pH范圍。這也說明，抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生與菌體的細(xì)胞生長并不是呈現(xiàn)嚴(yán)格的正比關(guān)系，而是都具有其最適pH及其能夠耐受的pH范圍。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)培養(yǎng)過程中抑菌作用的影響

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響 如圖3所示，培養(yǎng)溫度在37℃時(shí)菌體生長最好，同時(shí)抑菌物質(zhì)活性在37℃培養(yǎng)時(shí)達(dá)到最高，培養(yǎng)溫度超過37℃，抑菌物質(zhì)產(chǎn)量開始下降。說明此乳酸菌在最適生長溫度下抑菌物質(zhì)產(chǎn)量最高。培養(yǎng)溫度超過37℃，發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性都有不同程度的下降，這可能是隨著培養(yǎng)溫度的上升，抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生受到了抑制。

2.3.4 接種量對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響 圖4顯示，接種量為1%時(shí)，發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性均為最大。由此可知，接種量為1%時(shí)抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量最大。當(dāng)接種量超過1%時(shí)，發(fā)酵液對(duì)兩種細(xì)菌菌株的抑菌活性有不同程度的下降，可能是由于隨著接種量的增大，培養(yǎng)基內(nèi)乳酸菌之間生長競爭加劇，培養(yǎng)基性質(zhì)改變，環(huán)境條件惡化，使乳酸菌群體生長下降，因而抑菌物質(zhì)產(chǎn)量下降。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)培養(yǎng)過程中抑菌作用的影響

圖4 接種量對(duì)培養(yǎng)過程中抑菌作用的影響

2.3.5 種齡對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響 由圖5可知，當(dāng)種齡為6h時(shí)，此乳酸菌菌株生長量最大;種齡為8h時(shí)，發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性最大，種齡大于8h則抑菌物質(zhì)產(chǎn)量開始下降;種齡為6h時(shí)，發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性最大，種齡大于6h則抑菌物質(zhì)產(chǎn)量開始下降。由此說明，接種對(duì)數(shù)期的種子不僅可以獲得很高的菌體生長量，還可以獲得很高產(chǎn)量的抑菌物質(zhì)。這是因?yàn)閷?duì)數(shù)期種子生命力最為旺盛，接種后大大縮短了菌株適應(yīng)新環(huán)境的時(shí)間，因而迅速生長，并迅速合成抑菌物質(zhì)。此外，在同樣條件下產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性并不一致，這可能是由于抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌機(jī)理不同所致。

圖5 種齡對(duì)培養(yǎng)過程中抑菌作用的影響

2.3.6 供氧量對(duì)菌體生長的影響 供氧量對(duì)菌體生長的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3，結(jié)果表明，厭氧條件下乳酸菌菌株生長要優(yōu)于好氧條件。

表3 供氧量對(duì)菌體生長的影響

2.3.7 正交實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)條件的最佳組合 正交實(shí)驗(yàn)因素水平如表1。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，由R1的值可知，溫度對(duì)乳酸菌菌株的生長影響最大，各因素主次關(guān)系為溫度＞種齡＞接種量＞培養(yǎng)時(shí)間＞培養(yǎng)基初始pH。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果和進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定乳酸菌菌株生長的最佳培養(yǎng)條件組合是溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH為6.0，接種量4%，種齡12h，培養(yǎng)時(shí)間40h。

由R2的值可知，溫度對(duì)乳酸菌菌株產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的抑菌作用的影響最大，各因素的主次關(guān)系為溫度＞培養(yǎng)時(shí)間＞種齡＞培養(yǎng)基初始pH＞接種量。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果和進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定乳酸菌菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抑菌作用最大的最佳培養(yǎng)條件組合是溫度28℃，培養(yǎng)基初始pH為7.0，接種量2%，種齡10h，培養(yǎng)時(shí)間24h。

由R3的值可知，溫度對(duì)乳酸菌菌株產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)B.S的抑菌作用的影響最大，各因素的主次關(guān)系為溫度＞培養(yǎng)時(shí)間＞接種量＞種齡＞培養(yǎng)基初始pH。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果和進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定乳酸菌菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)B.S的抑菌作用最大的最佳培養(yǎng)條件組合是溫度28℃，培養(yǎng)基初始pH為6.5，接種量1%，種齡6h，培養(yǎng)時(shí)間40h。

2.4 抑菌物質(zhì)的特性分析［6－9］

2.4.1 溫度對(duì)發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)活性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵液經(jīng)高溫處理和未經(jīng)高溫處理都有抑菌作用，高溫高壓對(duì)發(fā)酵液的抑菌效果基本上沒有影響。因此，抑菌物質(zhì)耐高溫濕熱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

2.4.2 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液上清的抑菌活性的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，經(jīng)過蛋白酶處理的發(fā)酵液、蛋白酶并高溫處理的發(fā)酵液以及未經(jīng)處理的發(fā)酵液都有抑菌活性，而蛋白酶溶液沒有抑菌活性，可排除蛋白酶溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

蛋白酶處理、蛋白酶并高溫處理與未處理的發(fā)酵液抑菌圈相比，只是略微的縮小，說明發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶不敏感，對(duì)高溫也不敏感，發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)不是蛋白類。

以酵母菌為指示菌的實(shí)驗(yàn)抑菌圈更大，可能是由于指示菌菌液濃度不同造成的實(shí)驗(yàn)誤差，也可能是說明酵母菌對(duì)此種抑菌物質(zhì)更為敏感。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

2.4.3 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的過氧化氫排除 過氧化氫酶溶液對(duì)三種指示菌均沒有抑菌作用，經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液依然有抑菌作用，未經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液也有抑菌活性，經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液比未經(jīng)處理的發(fā)酵液的抑菌圈直徑小一些，說明發(fā)酵液中有抑菌作用的物質(zhì)是混合物，少量的過氧化氫也有抑菌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

2.4.4 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)酸的抑菌作用排除 發(fā)酵液的pH為3.75，相同pH的鹽酸和乳酸溶液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌都沒有抑菌作用;發(fā)酵液對(duì)這三種指示菌均有抑菌活性，說明發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)不是酸類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)酸的抑菌作用的排除(±s)，n=3

表8 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)酸的抑菌作用的排除(±s)，n=3

指示菌 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 酵母菌乳酸pH3.75 22.3±1.5 22.4±2.0 19.5±1.7 pH3.75 0.0 0.0 0.0鹽酸pH3.75 0.0 0.0 0.0發(fā)酵液

2.4.5 觀察不同pH對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 數(shù)據(jù)表明起抑菌作用的物質(zhì)在pH≥4.5時(shí)，基本無抑菌作用，在pH3.0～4.5時(shí)，有明顯的抑菌作用。抑菌圈在相應(yīng)的抑菌范圍內(nèi)隨著pH增大有所減小，說明這種抑菌物質(zhì)依賴酸作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

表4 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 溫度對(duì)發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)活性的影響(±s)，n=3

表5 溫度對(duì)發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)活性的影響(±s)，n=3

26.5±0.9 21.8±1.0 25.8±1.2未高溫處理的抑菌圈(mm)指示菌 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 酵母菌高溫滅菌后抑菌圈(mm) 28.7±3.2 25.2±2.7 26.4±1.1

表6 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液上清抑菌活性的影響(±s)，n=3

表6 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液上清抑菌活性的影響(±s)，n=3

17.6±4.2 16.3±1.3 18.7±2.4 0.0大腸桿菌 胰蛋白酶處理(mm) 14.7±0.6 18.3±0.6 19.1±0.6 0.0木瓜蛋白酶處理(mm) 17.5±1.2 18.8±0.9 18.0±3.2 0.0胃蛋白酶處理(mm) 15.4±1.5 15.9±1.3 18.5±2.1 0.0枯草芽孢桿菌 胰蛋白酶處理(mm) 16.3±0.4 17.6±3.1 17.1±2.5 0.0木瓜蛋白酶處理(mm) 14.0±1.3 17.7±0.1 16.6±0.8 0.0胃蛋白酶處理(mm) 25.9±0.2 14.0±2.3 29.7±0.6 0.0酵母菌 胰蛋白酶處理(mm) 28.3±0.6 25.4±1.8 24.1±2.1 0.0木瓜蛋白酶處理(mm)指示菌 蛋白酶的處理方式 蛋白酶處理 蛋白酶并高溫處理 未處理 蛋白酶溶液胃蛋白酶處理(mm) 20.7±2.4 21.0±1.7 17.3±3.0 0.0

表7 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的過氧化氫的排除(±s)，n=3

表7 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的過氧化氫的排除(±s)，n=3

注∶1－無菌MRS液體培養(yǎng)基;2－6mg/mL過氧化氫酶處理過的乳酸發(fā)酵液;3－未經(jīng)處理的發(fā)酵液;4－6mg/mL的過氧化氫酶無菌水溶液。

編號(hào)1234 0.0 16.3±1.0 23.4±1.2 0.0 0.0 20.6±1.5 24.1±0.2 0.0枯草芽孢桿菌抑菌圈(mm) 0.0 19.7±1.2 18.8±0.7 0.0酵母菌抑菌圈(mm)大腸桿菌抑菌圈(mm)

圖6 pH對(duì)發(fā)酵液的抑菌活性的影響

3 結(jié)論

經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)，證明本研究所采用的植物乳酸菌能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。該抑菌物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌及酵母菌均有抑菌作用，具有廣譜性;此物質(zhì)耐高溫，對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶不敏感，在pH＜4.5對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及部分真菌有抑制作用，是非過氧化氫物質(zhì);從初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，該物質(zhì)為非蛋白成分或非單一物質(zhì)，不符合細(xì)菌素的定義，推測其為類乳酸菌素。由于該植物乳酸菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)能抑制包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等在內(nèi)的常見食源性和人畜共患病的腐敗菌和病原菌，因此在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、食物防腐和醫(yī)藥等領(lǐng)域都有一定應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)還證明，抑菌物質(zhì)在細(xì)胞剛剛開始生長時(shí)就有產(chǎn)生，且產(chǎn)量很高。這意味著在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，只需將此乳酸菌菌株培養(yǎng)2～8h，就能獲得很高的抑菌物質(zhì)產(chǎn)量。這也決定了此乳酸菌菌株在將來有很廣闊的應(yīng)用前景。

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Characteristics and optimization producing conditions of bacteriocin－like from Lactobacillus plantrum

XIE Jun－mei，WEN Han*
(School of Life Science，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China)

Lactobacillus production of lactic acid bacteria bacteriocin culture conditions was optimized by single factor experiment and orthogonal and its characteristics was analyzed.The results showed that:the best vegetative growth of lactic acid bacteria was a combination of culture conditions at 30℃，initial pH6.0 with inoculum amount of 4%，seed age 12h，anaerobic conditions for 40h.Lactobacillus streptozotocin on Gram－negative bacteria and yeast inhibition optimum culture conditions for the largest combination of the temperature 28℃，initial pH7.0 with inoculum amount of 2%，seed age 10h，anaerobic conditions for 24h.Gram－positive lactic acid bacteria Streptomyces antibacterial effects had the best combination of culture conditions of temperature 28℃，initial pH 6.5 medium，inoculum 1%，seed age 6h，anaerobic conditions for 40h.Without effect of organic acids and hydrogen peroxide，the cell－free liquid culture of Lactobacillus showed high inhibitory activity against gram－positive bacterias，including Bacillus subtilis and Staphyloccocus aureus Rosenbach and gram－negative bacterias，such as Escherichia coli and Salmonella typhimunius，but also inhibited some fungi.Therefore，the inhibitory substance produced by the lactic acid bacteria was assumed bacteriocin－like substance.Lactic acid bacteria showed it was stable to heat，active at low pH，not sensitive to proteinasea and broad antibacterial spectrum.

optimization of fermentation conditions;orthogonal test;indicator bacteria;bacteriocin－like substance

TS201.2

A

1002－0306(2011)11－0093－06

2010－11－19 *通訊聯(lián)系人

解俊梅(1981－)，女，碩士研究生，研究方向:次生代謝產(chǎn)物。