氧氣對干酪乳桿菌生長和活力的影響

周元良，柳國霞，劉 飛，霍貴成

(乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江哈爾濱 150030)

氧氣對干酪乳桿菌生長和活力的影響

周元良，柳國霞，劉 飛，霍貴成*

(乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江哈爾濱 150030)

以靜置培養為對照，通過振蕩培養制造有氧環境，對干酪乳桿菌的生長曲線、菌體活力進行分析。研究發現在有氧條件下菌體生長受到抑制，菌體密度小于靜置發酵，在4℃保存時的活力迅速下降，另外，有氧生長菌體對熱、膽汁等條件的耐受性較差，在50℃處理4h導致菌體迅速死亡，在含有膽汁的培養基中，菌體生長幾乎停滯。通過透射電鏡觀察發現有氧條件下菌體細胞壁發生破裂，菌體細胞質成分溶出，導致菌體死亡。因此，氧氣對干酪乳桿菌的生長具有抑制作用，造成細胞損傷，導致菌體活力降低。

干酪乳桿菌，氧氣，菌體活力

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)屬于兼性厭氧乳酸菌，通常情況下進行無氧發酵，可作為乳制品發酵劑將乳糖等碳源代謝成乳酸［1］。在人體腸道微生態系統中，L.casei具有抗誘變、降低血清膽固醇等功能［2］，是一種重要的益生菌［3］。然而，在L.casei發酵過程中及含有L.casei的食品貨架期內都會使菌體接觸一定的氧氣，這是造成菌體活力下降的因素之一［4－5］。對乳球菌的研究表明，延長乳球菌與空氣接觸的時間會導致細胞死亡和DNA降解［7］;含有其他益生菌的食品在貨架期內菌體也會由于包裝內含有氧氣導致菌體活力迅速下降［8］。氧氣對乳酸菌的致死作用主要是由于分子氧形成的活性氧物質，如過氧化氫、羥自由基等，造成細胞蛋白質、類脂、核酸的損傷，從而使菌體死亡并導致下降［6］。在有氧條件下，NADH氧化酶和NADH過氧化物酶對L.casei的生長起關鍵作用。L.casei細胞內已發現這類酶及其輔酶FAD的存在［9］。由此可見，L.casei可以耐受一定量的氧氣，但是這種耐受限度較低，過量的氧氣接觸會造成菌體不可恢復的損傷［7］。有關L.casei與氧氣的相關研究鮮有報道。因此，本研究針對L.casei在有氧條件下的生長情況進行研究，探討氧氣對L.casei生長的影響，為其在工業中的應用提供有價值的參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

干酪乳桿菌L.caseiATCC393，培養條件∶50mL液體培養基分裝于500mL三角瓶中，接種過夜培養的新鮮菌液，接種量1%，培養溫度37℃，其中有氧培養為在搖床中震蕩培養，轉速200r/min［1］，厭氧培養為培養箱中靜置培養;MRS培養基(1L) 蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，吐溫80 1.1g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸氫二氨2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，蒸餾水950mL，固體培養基加1.7%瓊脂粉，121℃滅菌15min;胰蛋白胨、酵母粉 OXOID公司;蛋白胨、牛肉膏、牛膽汁

北京奧博星公司;硫酸鎂、硫酸鋅、葡萄糖 天津市天力化學試劑有限公司;乙酸鈉 天津市博迪化工有限公司;檸檬酸氫二氨、磷酸氫二鉀 天津市科密歐試劑公司;瓊脂粉 Solarbio公司;NADH、FAD美國Sigma公司;以上試劑均為分析純級。

生化培養箱SPX－150B 上海佳勝實驗設備有限公司;超凈工作臺CJ－2D 天津泰斯特;分析天平PL2002 瑞士METTLER TOLEDO;恒溫搖床HWY－100B 上海智誠;紫外－可見分光光度計DU－800美國BECKMAN;壓力蒸汽滅菌器HVE－50 日本HIRAYAMA;透射電鏡H－7650 日本HITACHI;離心機GL－20G－Ⅱ。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線測定 兩種培養條件下的菌液自4h開始至24h，每隔2h取樣測定菌體OD600和pH。10h以后菌體需經適當稀釋后進行OD600測定。

1.2.2 活菌計數 兩種培養條件下的菌液采用平板菌落計數法測定活菌數［10］。每個稀釋度做三個平行，于37℃培養48h后取出，靜置于4℃冰箱中。取樣時間分別為12h，24h，5d，10d和15d。

1.2.3 菌體耐熱性測定 將兩種培養條件下的48h培養物置于50℃水浴中放置4h，用1.2.2中的平板菌落計數法計活菌數。

1.2.4 菌體耐膽汁活力 將兩種培養條件下的48h培養物接種1%于含有0.3%牛膽汁的滅菌MRS培養基中并按1.2.2方法進行活菌計數，于37℃培養3h后再計數，比較二者菌體生長受抑制程度［11］。

1.2.5 菌體NADH氧化酶系活力測定 將10mL的24h培養物，10000×g，4℃離心10min，收集的菌體用PBS緩沖液(pH6.0)洗三次，并重懸于PBS緩沖液中并超聲破碎(功率150W，工作時間3s，間隔時間5s，總時間30min)，1000×g，4℃離心10min，收集上清液。反應體系含有 100μmol/L NADH，20μmol/L FAD，50mmol/L PBS緩沖液(pH6.0)，10μL酶提取液，25℃保溫，每3min測定A340，做出曲線并計算斜率，根據斜率大小比較NADH氧化酶系活力［12］。

1.2.6 透射電鏡觀察 樣品制備∶48h菌體培養液置于1.5mL EP管中，4℃，5000×g離心10min，棄上清液，菌體用 2.5%戊二醛固定，于 4℃放置過夜。0.1mol/L PBS緩沖液洗滌三次后用四氧化鋨固定2.5h。再用0.1mol/L PBS清洗三次后依次用50%、70%、80%、90%、100%乙醇、1∶1的乙醇－丙酮和100%丙酮脫水。脫水后用梯度濃度的丙酮與包埋劑浸透過夜，次日包埋，聚合3d，再經修塊、切片和染色后進行電鏡觀察［13］。電鏡條件∶100kV，放大倍數∶6×104倍。

1.2.7 統計分析 采用SPSS13.0和EXCEL對數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 不同培養方式下L.casei的生長曲線

分別測定了靜置培養(NO)和搖床培養(O)兩種條件下L.casei的生長曲線，見圖1。

由圖1所示，在兩種條件下菌體產酸量和變化趨勢均一致，表明氧氣對L.casei的發酵產酸影響較小。但是從菌體密度來看，10h前二者變化相近，12h開始后搖床培養條件下菌體生長明顯受到抑制(P＜0.05)，菌體密度增長變慢，最終菌體密度也低于靜置培養條件下的菌體?？梢钥闯鲅鯕鈱w的抑制主要作用在對數生長期。這是由于處在對數生長期的菌體代謝旺盛，對外界環境因素如酸、熱、氧化等抵抗力較差［14］，而氧氣的存在以及超氧化物的生成使菌體受到脅迫，生長被抑制［6］，使菌體生長的對數期減短，菌體較早進入穩定期，從而導致最終菌體密度較低。

圖1 兩種培養條件下L.casei生長曲線

2.2 活菌計數

兩種條件下培養物中活菌數變化情況如圖2所示。兩種條件下24h前活菌數相當，且在4℃條件下放置后，二者菌體活力均迅速下降，搖床培養的活菌數對數值在10d即下降到0，而同一時期靜置培養的菌體活力還保持在104以上。這表明在培養過程中其菌體細胞可能受到損傷，從而導致在冷藏條件下菌體無法適應外界條件而大量死亡。而且在這一過程中可能生成的活性氧物質也會造成菌體死亡。這說明有氧條件下培養物中生成的超氧化物在菌體保存過程中對菌體進一步刺激，導致菌體大量死亡［7］。

圖2 兩種培養條件下L.casei活力變化情況

2.3 菌體耐熱性

由圖3可以看出，搖床培養條件下熱處理后的菌體活力下降明顯(P＜0.05)，其活菌數對數值下降7.1，表明其培養物中活細胞對外界熱處理條件敏感，菌體死亡率增加。而靜置條件下熱處理后菌體活力下降幅度不明顯(P＞0.05)，僅為1.77，表明該菌體對外界熱處理具有一定的抵抗力。搖床培養條件下菌體熱抵抗力差與其菌體活力差有關。乳酸菌最高耐受生長溫度是53℃［15］，搖床培養條件下菌體活力在50℃迅速下降表明菌體發生了不利于耐受高溫的變化。這一變化主要是由于菌體活力降低以及菌體細胞的氧化損傷。

2.4 菌體耐膽汁活力

兩種培養條件下菌體對膽汁的耐受性有明顯差異(P＜0.05)，如圖4所示。靜置培養條件下菌體在生長3h后活菌數對數值增加0.6，而同期搖床培養的菌體活力只上升0.1個對數值。這表明在含有0.3%膽汁的培養基中，搖床培養的菌體生長受到明顯抑制(P＜0.05)，生長幾乎停滯。菌體對膽汁的耐受性程度也與其菌體活力有關，正是由于在有氧條件下其菌體活力下降，所以導致L.casei在膽汁培養基中生長受抑制。

圖3 兩種培養條件下L.casei菌體的耐熱性

圖4 兩種培養條件下L.casei菌體的耐膽汁活性

2.5 NADH氧化酶系活力

由兩種條件下細胞NADH氧化酶系活力可看出，L.casei菌體細胞NADH氧化酶系活力很低，同時，搖床培養菌體的酶活力是靜置培養條件下酶活力的2.8倍。這表明過多的氧氣會刺激菌體通過自身代謝途徑的改變來降低氧氣對細胞的毒性作用。因此，通常情況下，在接觸少量的氧氣時，L.casei生長不會受到抑制。但是當大量的氧氣在其整個生長過程中出現時，其NADH氧化酶系不足以消除氧氣帶來的氧化損傷，菌體生長及活力均出現下降趨勢［9］。

圖5 兩種培養條件下L.casei NADH氧化酶系活力

2.6 細胞電鏡觀察

兩種條件下細胞的電鏡觀察結果如圖6所示。由圖6可以看出，在靜置培養條件下，L.casei具有完整的細胞壁，而在搖床培養條件下部分菌體細胞壁發生破裂，導致胞內物質溶出。這種變化會直接造成菌體死亡和菌體活力下降。另外，靜置培養菌體細胞壁較厚，表面粗糙，搖床培養得到的菌體細胞壁較薄，且表面光滑。這些變化都是在其生長過程中與氧氣接觸造成。一方面，菌體接觸的氧氣或者生成的超氧化物對細胞壁產生了刺激作用，導致其變薄和光滑，部分細胞由于所受刺激超過細胞壁承受限度，使細胞壁發生破裂，導致菌體自溶。這些因素都會導致菌體活力迅速下降，不利于菌體的保存。

3 結論

圖6 兩種培養條件下L.casei細胞的透射電鏡照片

在有氧條件下，兼性厭氧菌L.casei的生長會由于氧氣的存在而受到抑制，這種抑制表現在菌體生長減慢和菌體活力下降，包括菌體的耐熱、耐冷藏、耐膽汁活力的下降。造成這種抑制作用的主要原因是菌體在有氧生長過程中培養物中產生的超氧化物對菌體造成的破壞作用［6－7］。因此，氧氣在L.casei生長過程中出現是不利的。雖然少量的氧氣可以通過NADH氧化酶/過氧化酶體系代謝［9］，但這類酶在L.casei細胞內活性較低，當過量的氧氣接觸菌體依然會對菌體造成損害。大多數應用L.casei的發酵劑、益生菌食品等在生產加工以及產品儲存過程中都會不可避免接觸一些氧氣［4］，進而使發酵劑或產品中菌體活力下降，導致發酵性能下降和食品使用價值降低。

［1］Pappy J R，Kesavan M N，Athira S N，et al.L(+)－Lactic acid production using Lactobacillus Caseiin solid－state fermentation［J］.Biotechnology Letters，2005，27:1685－1688.

［2］Nagendra P S.Functional cultures and health benefits［J］. International Dairy Journal，2007，17(11):1262－1277.

［3］Inmaculada N，Juan R，Gaspar P，et al.Diacetyl and acetoin production from whey permeate using engineered Lactobacillus casei［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2009，36:1233－1237.

［4］Akshat T，Kaila K.The Role of Oxygen in the viability of probiotic bacteria with reference to L.acidophilus and Bifidobacterium spp ［J］ .Current Issues in Intestinal Microbiology，2004(5):1－8.

［5］Donkor，Nilmini，Stolic，et al.Survival and activity of selected probiotic organisms in set－type yoghurt during cold storage［J］. International Dairy Journal，2007，7(6):657－665.

［6］付良，劉飛，霍貴成.一株能夠利用血紅素進行有氧呼吸的乳酸乳球菌［J］.微生物學報，2008，48(9):1256－1259.

［7］Maarten G，Pascale S，Christian C，et al.Stress responses in lactic acid bacteria［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2002，82: 187－216.

［8］Craig M，Minh N，Michael R，et al.The influence of packaging materials on the dissolved oxygen content of probiotic yoghurt［J］.Packaging Technology and Science，2008，15(3):133－138.

［9］Mitsuo S，Kazuo K.Aerobic growth of and activities of NADH oxidase and NADH peroxidase in Lactic Acid Bacteria［J］. Journal of Fermentation and Bioenoineer，1996，82(3):210－216.

［10］Liong，Shah.Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli Strains［J］.Journal of Dairy Science，2005，88:55－66.

［11］Fellix L D F，Michile K，Willem，et al.Cofactor engineering:a novel approach to metabolic engineering in Lactococcus lactis by controlled expression ofNADH oxidase［J］.Journalof Bacteriology，1998，180(15):3804－3808.

［12］Carmen K，Jorg O T，Sybille H，et al.Multi－step assembly pathway of the cbb3－type cytochrome c oxidase complex［J］. Journal of Molecular Biology，2006，355:989－1004.

［13］Michelle C，Lynn M，Trevor B.Electron microscopic analysis of dairy microbes inactivated by ultrasound［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2010，15:960－964.

［14］劉懷龍，孟祥晨.酸適應乳酸菌的篩選及其酸適應條件的研究［J］.山東大學學報，2008，43(7):51－55.

［15］張剛.乳酸細菌－基礎、技術和應用［M］.北京:化學工業出版社，2007:99.

Influence of oxygen to the growth and survival of Lactobacillus casei

ZHOU Yuan－liang，LIU Guo－xia，LIU Fei，HUO Gui－cheng*
(Key laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The growth curve and survival of L.casei under aerobic and anaerobic conditions were obtained by culturing with and without shaking respectively.The growing of L.casei inhibited by oxygen，which had a decreased growth yield compared with standing fermentation and a survival of reduced rapidly when stored at 4℃.Aerobic cultured L.casei had a bad tolerance in MRS media contain 0.3%bile，which also made a dominant cells death by treating with 50℃ for 4 hours.The cell walls rupturing and cytoplasm of aerobic cells dissolution were observed by transmission electron microscope，which induced the death of cells.Accordingly，influence of oxygen to L.casei was inhibiting growth，breaking cell walls and leading to poor survival.

Lactobacillus casei;oxygen;survival of cells

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0209－04

2010－11－26 *通訊聯系人

周元良(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:食品科學。

教育部長江學者和創新團隊發展計劃(IRTO959)。