瓠瓜胰蛋白酶抑制劑的提取

馬 勇，王國洋，張麗娜

(渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州 121000)

瓠瓜胰蛋白酶抑制劑的提取

馬 勇，王國洋，張麗娜

(渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州 121000)

采用水提法從瓠瓜中提取胰蛋白酶抑制劑，以瓠瓜提取液對胰蛋白酶的抑制率為指標，研究了提取溫度、液料比、提取時間、pH四個主要影響因素，優化選出最佳提取方案。從瓠瓜中提取胰蛋白酶抑制劑的最佳條件為:溫度70℃、pH=8、液料比4∶1(mL/g)、提取時間1h。

瓠瓜，胰蛋白酶抑制劑，提取

胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor，TI)是一種重要的生化藥物和生化試劑，廣泛存在于動、植物和微生物中，泛指具有胰蛋白酶抑制作用的多肽或蛋白質，能與相應的蛋白水解酶形成一定的動態平衡，調節生物體內許多重要的生命活動［1－2］。根據其來源不同可分為多種，如從牛肺或牛胰中提取的抑肽酶(aprotinin)、從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑(urinary trypsin inhibitor，UTI)、從大豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor，SBTI)等。食物中的植物胰蛋白酶抑制劑如果沒有被除去或抑制，它在體內能與小腸液中胰蛋白酶、糜蛋白酶結合，生成無活性復合物，消耗和降解胰蛋白酶，導致腸道對蛋白質消化、吸收及利用能力下降，導致胰腺腫大和體內氨基酸代謝失調等疾病。但也有報導大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療、調節胰島素失調有一定效果［3－4］。瓠瓜為葫蘆科葫蘆屬植物瓠瓜的果實，具有清熱利水、止渴、解毒功效，適應于治療水腫腹脹、煩熱口渴、肺炎、腸炎、糖尿病等癥。瓠瓜含有蛋白質及多種微量元素，有助于增強機體免疫功能。同時，瓠瓜中含有豐富的維生素C，能促進抗體的合成，提高機體抗病毒能力。瓠瓜中存在胰蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶有抑制作用，從而具有降血糖的效果。本實驗通過單因素實驗和正交實驗確定胰蛋白酶抑制劑活性成分的最佳提取條件。對瓠瓜蛋白酶抑制劑的深入研究和應用具有推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白酶 北京奧博星生物技術責任有限公司; BAPNA sigma;二甲亞砜 國藥集團化學試劑有限公司;3－羥甲基－氨基甲烷、無水氯化鈣、鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉 國產分析純;新鮮瓠瓜 錦州閭山產。

UV－1900雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;RE52－86A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;PB－10酸度計 北京賽多利斯儀器系統有限公司;HH－501超級恒溫水浴 金壇市科析儀器有限公司;FA2004電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司;TD5A－WS型離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定方法 以瓠瓜提取液對胰蛋白酶的抑制率為指標，研究瓠瓜中胰蛋白酶抑制劑的最佳提取條件。瓠瓜中胰蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶的抑制率測定［5］，采用 BAPNA法。取1mL樣品提取液，加1mL蒸餾水，加入5mL BAPNA溶液，于37℃恒溫10min后，立即加入1mL 30%三氯乙酸終止反應，在410nm波長處測定吸光度［6］。從而計算出抑制率。抑制率公式∶

式中∶η－樣品提取液對胰蛋白酶的抑制率; A0－胰蛋白酶溶液的吸光度;Ai－樣品溶液的吸光度; Ab－樣品溶液對照空白的吸光度。

1.2.2 提取工藝 瓠瓜經去皮搗碎后，得到瓠瓜樣品，取20g處理后的瓠瓜樣品，按一定的液料比，加入蒸餾水，在一定的溫度下提取一段時間后，對提取液進行抽濾，減壓濃縮到一定體積(≤50℃)，3500r/ min離心15min，定容至刻度，即得樣品待測液，按1.2.1的方法進行測定。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

圖1 溫度對抑制率的影響

2.1.1 溫度對抑制率的影響 取20g樣品加150mL蒸餾水，調節pH=7，分別在50、60、70、80、90、100℃水浴中提取1h，抽濾，減壓濃縮(≤50℃)到20mL，離心，測定抑制率。由圖1結果可以看出，隨著溫度的升高，抑制率有增大的趨勢，當溫度達到70℃時抑制率最大;之后，溫度繼續升高，抑制率則有所下降。這可能是由于溫度過高影響了瓠瓜胰蛋白酶抑制劑的活性。因此，提取溫度在70℃左右為宜。

2.1.2 pH對抑制率的影響 取20g樣品加150mL

蒸餾水，分別調pH為3、5、7、9和11，在70℃水浴中提取1h，抽濾，減壓濃縮(≤50℃)到20mL，離心，測定抑制率。

圖2 pH對抑制率的影響

由圖2結果可以看出，在pH小于7時，隨pH的增大抑制率逐漸增大;在pH達到7后隨pH的增大，抑制率開始降低。說明在中性條件下瓠瓜胰蛋白酶抑制劑抑制效果最好。

2.1.3 液料比對抑制率的影響 取20g樣品分別加40、80、120、160、200mL蒸餾水，調節pH=7，在70℃水浴中提取1h，抽濾，減壓濃縮(≤50℃)到20mL，離心，測定抑制率。

由圖3結果可以看出，隨著液料比的增大，抑制率增大，在液料比達到6∶1后，抑制率不再增大。說明瓠瓜胰蛋白酶抑制劑已經充分溶解到水溶液中。

2.1.4 提取時間對抑制率的影響 取20g樣品加120mL蒸餾水，調節pH=7，在70℃水浴中分別提取0.5、1、2、3、4h，抽濾，減壓濃縮(≤50℃)到20mL，離心，測定抑制率。

圖3 液料比對抑制率的影響

圖4 提取時間對抑制率的影響

由圖4結果可以看出，隨著提取時間的延長，抑制率不斷增大，提取1h后抑制率變化幅度減小，提取2h后抑制率不再增大。說明2h可以將瓠瓜胰蛋白酶抑制劑基本提取完全。考慮到實驗條件及成本等問題，采取的提取時間為1h。

2.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選用L9(33)正交實驗進行優化，以此確定瓠瓜胰蛋白酶抑制劑的最佳提取條件，見表2(正交因素水平見表1)。

表1 正交因素水平

表2 正交實驗方案及結果

分析結果表明∶三種考察因素對胰蛋白酶抑制劑抑制率的影響順序為B＞C＞A，即pH對實驗結果影響最大，液料比的影響次之，提取溫度的影響稍小。由K值可以得出影響因素最佳組合為A2B3C1，即提取溫度為70℃，pH為8，液料體積比為4∶1。當提取時間為1h時，A2B3C1組合的抑制率為76.45%。

3 結論

3.1 從瓠瓜中提取胰蛋白酶抑制劑的最佳條件為∶溫度為70℃，pH為8，液料比為4∶1，提取時間1h。

3.2 瓠瓜中的胰蛋白酶抑制劑比較耐高溫，在70℃后抑制率開始下降，但仍具有較高的抑制率，在100℃時仍有活性，具有較好的熱穩定性［7－9］。

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Extraction of trypsin inhibitor in gourd

MA Yong，WANG Guo－yang，ZHANG Li－na

(College of Biotech and Food Science，Bohai University，Jinzhou 121000，China)

The trypsin inhibitor in gourd was obtained by a water－extracting method.The extraction temperature，liquid/material ratio，extraction time and pH value were considered as four important factors to determine the optimal extraction factors，with the inhibition of gourd extracts on trypsin as the reference.The optimal extraction conditions were proved to be with liquid/material ratio(mL/g)4∶1，extraction time 1 hour at 70℃ and pH=8.

gourd;trypsin inhibitor;extraction

TS201.2+5

B

1002－0306(2011)11－0299－03

2010－12－06

馬勇(1960－)，男，博士，教授，研究方向:食品檢驗與食品開發。