超聲波酶法提取豆渣中水溶性多糖條件的優(yōu)化

田瑞紅，江連洲，，*，胡少新，王 鑫，王文睿

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱 150030)

超聲波酶法提取豆渣中水溶性多糖條件的優(yōu)化

田瑞紅1，江連洲1，2，*，胡少新2，王 鑫1，王文睿1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱 150030)

以水酶法提油后的副產(chǎn)物豆渣為原料，采用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取水溶性大豆多糖。在相同的超聲波條件下(超聲功率150W、超聲溫度88℃、超聲時間17min、液固比28∶1、六偏磷酸鈉溶液濃度2%)對水酶法提油后的豆渣進行預(yù)處理，在此基礎(chǔ)上考察Viscozyme L復(fù)合纖維素酶對水溶性大豆多糖提取率的影響，首先對提取工藝進行單因素的選擇，然后設(shè)計三因素三水平的正交實驗，確定超聲波協(xié)同纖維素酶法提取水溶性大豆多糖的最佳工藝條件為:液固比28∶1，酶解時間1.5h，酶解溫度45℃，纖維素酶用量0.4%，pH4.0。在此條件下，超聲波酶法的提取率為25.92%，與超聲波法的水溶性大豆多糖的提取率(11.51%)相比，提高了14.41%。

水溶性大豆多糖，超聲波，超聲波酶法

水溶性大豆多糖是一種酸性多糖，結(jié)構(gòu)類似于果膠，主要由酸性糖(半乳糖醛酸聚糖、鼠李二半乳糖醛酸聚糖)主鏈和中性糖(阿拉伯聚糖和半乳聚糖)支鏈組成［1］。一方面，作為一種天然的生物活性物質(zhì)，水溶性大豆多糖具有免疫活性和抗氧化性［2］，且具有預(yù)防心腦血管病、糖尿病、膽結(jié)石、肝炎等疾病的多種功能［3］;另一方面，作為一種良好的食品添加劑，水溶性大豆多糖具有穩(wěn)定性［4］、分散性、乳化性［5］和黏著性［6］等多種功能［7］，因此在食品行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。從20世紀(jì)70年代開始國內(nèi)外均有關(guān)于水溶性大豆多糖提取的相關(guān)報道，但多數(shù)以加工大豆食品(如豆腐、腐竹、腐干、豆乳等)的副產(chǎn)物豆渣為原料，目前還未見對水酶法提油后的豆渣中水溶性大豆多糖提取工藝的研究。超聲波提取作為一種先進的水溶性大豆多糖提取方法，已被廣泛應(yīng)用于水溶性大豆多糖的提取，但是采用超聲波技術(shù)結(jié)合纖維素酶提取水溶性大豆多糖的報道很少。為了驗證此方法對水酶法提油后豆渣中水溶性多糖的提取效果，本實驗采用正交實驗設(shè)計法優(yōu)化得出了超聲波協(xié)同纖維素酶提取水溶性大豆多糖的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆渣 實驗室水酶法提油后的殘渣;Viscozyme L復(fù)合纖維素酶(5108單位/g) 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;蒸餾水，葡萄糖，苯酚，硫酸，無水乙醇。

721分光光度計 上海第三分析儀器廠;電子分析天平 梅特勒－托利多儀器上海有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;LK－200A型中草藥粉碎機 浙江溫嶺儀器廠;SHZ－Ⅲ型循環(huán)水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠;G1－21M 離心機上海市離心機械研究所; ES－2030型冷凍干燥儀 日本Hitachi公司;KQ－500DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析測定方法 蛋白質(zhì)含量的測定參照GB/T 5009.5－ 2003;脂肪含量的測定參照 GB/T 5009.6－ 2003;淀粉含量的測定采用費林試劑熱滴定定糖法;總膳食纖維含量的測定參照GB 22224－ 2008;水分含量的測定參照GB/T 5009.3－2003。

1.2.2 水溶性大豆多糖提取的工藝流程 水酶法提油后的豆渣→烘干→粉碎(過40目篩)→索氏提取(乙醚脫脂)→干燥→配制為液固比為28∶1的溶液→超聲波預(yù)處理→冷卻→酶解(纖維素酶)→滅酶→多次抽濾→離心(4000r/min，15min)→取上清液→去蛋白(加三氯乙酸)→離心(4000r/min，15min)→取上清液→減壓濃縮至原體積的1/4→醇析→離心→洗滌干燥→多糖粗品

1.2.3 水溶性大豆多糖純度及提取率的測定

1.2.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100mg(預(yù)先于105℃烘至恒重)置于1000mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL，加水補至2.0mL，然后加6%的苯酚溶液1.0mL及濃硫酸5.0mL，靜置10min搖勻，室溫放置20min以后于490nm下測定OD值。以2.0mL蒸餾水為空白對照，橫坐標(biāo)為多糖含量(μg/mL)，縱坐標(biāo)為OD值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程∶y=0.0094x－0.0084，r=0.9998，適用范圍x=20～180μg/mL。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

多糖純度=樣品溶液的葡萄糖重量×樣品溶液的稀釋倍數(shù)/粗提物質(zhì)量;多糖提取率(%)=粗提物質(zhì)量×純度/豆渣干重×100%

1.2.4 單因素實驗設(shè)計 在優(yōu)化后的超聲波提取條件的基礎(chǔ)上進行預(yù)處理，以液固比28∶1為固定條件，利用單因素實驗分別考察纖維素酶的添加量、溶液pH、提取時間及酶解溫度4個因素對水酶法提油后的豆渣中水溶性大豆多糖純度和提取率的影響程度，選擇最佳的提取工藝條件。

1.2.5 正交實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，確定纖維素酶的添加量(%對底物)、提取溫度、溶液的pH為影響提取率和純度的主要因素，設(shè)計L9(34)正交實驗，如表1所示。其他條件為液固比28∶1，提取時間1.5h。

表1 超聲波酶法正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆水溶性多糖提取率的比較

以水酶法提油后的豆渣為原料，分別采用超聲波處理工藝(超聲功率150W、超聲溫度88℃、超聲時間17min、液固比28∶1、六偏磷酸鈉溶液濃度2%)和超聲波輔助纖維素酶解工藝(在超聲處理的基礎(chǔ)上進行纖維素酶法提取∶液固比28∶1，酶解時間1.5h，酶解溫度55℃，纖維素酶用量0.6%，pH5.0)制備水溶性大豆多糖，其提取率見表2。

表2 水溶性大豆多糖提取率的比較

由表2可知，以水酶法提油后的豆渣為原料，不同的處理條件，大豆水溶性多糖產(chǎn)率差異極顯著，超聲法酶法提取大豆水溶性多糖的提取率明顯優(yōu)越于超聲波工藝的提取率。以水酶法提油后的豆渣為原料，采用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取的水溶性大豆多糖提取率高，故超聲波酶法提取大豆水溶性多糖的處理參數(shù)應(yīng)重新加以優(yōu)化，以便進一步提高其產(chǎn)率。

畢總還特別提到，中美貿(mào)易戰(zhàn)中對叉車也加征了關(guān)稅，造成了中國叉車品牌在海外市場的價格相對上漲，比亞迪叉車也在其中。海外客戶則表示，相較于比亞迪叉車為企業(yè)節(jié)省的生產(chǎn)成本，比亞迪叉車仍是非常好的選擇。

2.2 超聲波酶法提取水溶性大豆多糖單因素研究

2.2.1 纖維素酶的酶解溫度對水溶性大豆多糖提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)溫度在35～50℃時，水溶性大豆多糖(SSPS)提取率和純度均隨溫度的升高而升高，但多糖純度在45～50℃變化不大而提取率達到最大;當(dāng)溫度在50～60℃時，SSPS的提取率和純度均隨著溫度的升高而降低。這是由于適當(dāng)?shù)募訜峥墒姑富钚赃_到最佳狀態(tài)，同時也使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，暴露出更多的酶作用位點∶但當(dāng)溫度過高時，酶蛋白部分變性，反應(yīng)速度下降［9］，因此最佳酶解溫度確定為50℃。

圖2 纖維素酶的酶解溫度對水溶性大豆多糖提取率的影響

2.2.2 纖維素酶添加量對水溶性大豆多糖提取率的影響 由圖3可以看出，當(dāng)加酶量為0.2%～0.6%時，隨著加酶量的增加，水溶性大豆多糖的提取率顯著增加;當(dāng)酶添加量為0.4%時，水溶性大豆多糖的提取率最高，為25.70%。根據(jù)米氏學(xué)說，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r，游離酶越多，越容易與底物結(jié)合成中間反應(yīng)物，中間反應(yīng)物再分解成反應(yīng)產(chǎn)物，這樣反應(yīng)速度就越快，在相同的時間下，底物分解的就越徹底［10］;但隨著纖維素酶添加量的增加，SSPS被進一步降解成較低分子量的多糖、低聚糖或單糖，在用乙醇沉淀時，因為分子量較小而不能被沉淀下來，從而使SSPS得率逐漸降低［11］。因此，選取0.4%為最適的纖維素酶添加量。

圖3 纖維素酶添加量對水溶性大豆多糖提取率的影響

2.2.3 溶液pH對水溶性大豆多糖提取率的影響由圖4可知，當(dāng)溶液pH為3.0～4.0時，SSPS的提取率和純度都隨著pH的增大而提高;pH為4.0時，SSPS的提取率和純度達到最大，分別達到24.98%和48.34%;當(dāng)pH在4.0～4.5之間時，SSPS的提取率仍略有升高，但純度趨于平緩，之后二者呈現(xiàn)大幅度下降的趨勢。大部分酶的活力受其pH的影響，在一定的pH條件下，酶活力最高，酶促反應(yīng)的速度達到最大，高于或低于此值時反應(yīng)速度下降［12］，這說明溶液pH是決定酶催化活性的重要參數(shù)之一。一方面過酸或過堿可改變酶的空間構(gòu)象，使酶失活;另一方面，pH還可以改變反應(yīng)底物的解離狀態(tài)，影響其與酶的結(jié)合［13］。因此，綜合考慮后，選取4.5為酶解的最適pH。

圖4 溶液pH對水溶性大豆多糖提取率的影響

2.2.4 酶解時間對水溶性大豆多糖提取率的影響由圖5可以看出，當(dāng)酶解時間為0.5～1.5h時，SSPS的提取率呈升高趨勢;當(dāng)時間達到1.5h時，提取率基本達到最大值，之后趨于平緩;而多糖純度在0.5～1.0h時呈上升趨勢，在1.0～1.5h之間趨于平緩，之后呈下降趨勢。這是由于在提取初期，底物濃度較高，水溶性多糖濃度較低，對酶反應(yīng)的抑制作用小，隨著時間的延長，酶的作用也越充分，SSPS的提取率迅速升高;但隨著時間足夠長，底物濃度的不斷降低及水溶性多糖的不斷積累，產(chǎn)物的反饋抑制作用逐漸增強，酶促反應(yīng)速度逐漸降低，最終達到平衡;同時，由于時間的延長，酶有更多的機會作用于已經(jīng)提取出的水溶性大豆多糖，而使多糖純度有所降低。因此綜合考慮成本問題，1.5h為最佳酶解時間。

圖5 酶解時間對水溶性大豆多糖提取率的影響

2.3 正交實驗結(jié)果分析

以多糖提取率和純度為指標(biāo)，采用L9(34)正交實驗來確定超聲波酶法提取的最佳條件，正交實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果

由極差分析和方差分析結(jié)果得出∶3個因素對多糖提取效果影響大小依次為A＞B＞C，即酶解溫度＞纖維素酶用量＞pH，且酶解溫度對多糖提取率的影響達到極顯著水平，纖維素酶用量對多糖提取率的影響達到顯著水平，而pH對多糖提取率的影響不顯著。理論最佳工藝條件為 A1B3C1，即酶解溫度45℃，纖維素酶用量0.6%，pH4. 0;而影響多糖純度的因素主次順序為B＞C＞A，即纖維素酶用量＞pH＞酶解溫度，且三者對多糖純度均有顯著影響，最佳組合為A1B2C1，即酶解溫度45°C，纖維素酶用量0.4%，pH4.0。但是從表2中可以直觀看出，A1B3C3組合多糖提取率最高，而A2B2C3多糖純度最高，均與理論分析得出的最佳結(jié)果不一致，為了比較這4個組合的優(yōu)劣進行3個水平的驗證實驗(表4)。

表3 方差分析表

表4 驗證實驗

由表4可以看出，四組實驗結(jié)果相比較，從多糖提取率來看，A1B3C1與A1B2C1的提取率相對較高，但彼此之間差異不顯著，但是與A1B3C3及A2B2C3之間存在顯著性差異;從多糖純度來分析，A1B2C1的多糖純度最高，且與A1B3C1、A1B3C3及A2B2C3差異極顯著。因此確定超聲波輔助纖維素酶法提取的最佳工藝條件為A1B2C1，即在超聲波的預(yù)處理后(超聲功率150W、超聲溫度88℃、超聲時間17min、液固比28∶1、六偏磷酸鈉溶液濃度2%)冷卻，纖維素酶用量0.4%，酶解時間1.5h，酶解溫度45℃，pH4.0。

3 結(jié)論

3.1 以水酶法提油后的豆渣為原料，分別采用超聲波處理工藝(超聲功率150W、超聲溫度88℃、超聲時間17min、液固比28∶1、六偏磷酸鈉溶液濃度2%)和超聲波輔助纖維素酶解工藝(在超聲處理的基礎(chǔ)上進行纖維素酶法提取∶液固比28∶1，酶解時間1.5h，酶解溫度55℃，纖維素酶用量0.6%，pH5.0)制備水溶性大豆多糖，水溶性大豆多糖產(chǎn)率差異極顯著，超聲法酶法提取水溶性大豆多糖的提取率(21.03± 0.03b)明顯優(yōu)越于超聲波工藝的提取率(11.51± 0.02a)。以水酶法提油后的豆渣為原料，采用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取水溶性大豆多糖提取率高，故超聲波酶法提取大豆水溶性多糖的處理參數(shù)應(yīng)重新加以優(yōu)化，以便進一步提高其產(chǎn)率。

3.2 超聲波輔助纖維素酶法提取水酶法副產(chǎn)物豆渣中水溶性多糖的最佳工藝條件為∶料液比28∶1，酶解時間 1.5h，酶解溫度 45℃，纖維素酶用量 0.4%，pH4.0。在此條件下，超聲波酶法的提取率為25.92%，與單一的超聲波法的水溶性大豆多糖的提取率(11.51%)相比，提高了14.41%。

3.3 水酶法提取植物油脂以其諸多優(yōu)點逐漸成為研究的中心，而大豆以其蛋白含量高、品質(zhì)優(yōu)的優(yōu)點，已成為最為典型水酶法提油的研究課題。本實驗以水酶法提油后的豆渣為原料，優(yōu)化了超聲波酶法提取水溶性多糖的工藝參數(shù)，從而實現(xiàn)對水酶法提油副產(chǎn)物的綜合利用，提高水酶法提油的附加值。為水酶法提油副產(chǎn)物豆渣的再利用提供理論依據(jù)與技術(shù)支持，為今后的進一步研究提供基礎(chǔ)的工藝數(shù)據(jù)。

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Preparation of water soluble soybean polysaccharides from soybean residue produced by ultrasonic－enzymatic extraction

TIAN Rui－h(huán)ong1，JIANG Lian－zhou1，2，*，HU Shao－xin2，WANG Xin1，WANG Wen－rui1
(1.Northeast Agricultural University，Institute of Food，Harbin 150030，China; 2.Soybean Engineering Technology Research Center of China，Harbin 150030，China)

Ultrasonic－enzymatic extraction conditions of water soluble soybean polysaccharides from soybean residue produced by aqueous enzymatic extraction were optimized.Raw material(soybean residue)was pretreated under the same ultrasonic condition(ultrasonic power 150W，ultrasonic temperature 88℃，ultrasonic time 17min，ratio of liquid to solid 28∶1，buffer concentration 2%).On the basis of ultrasonic pretreatment，optimal enzymatic extraction conditions of SSPS were studied by single and orthogonal tests.The optimal conditions of ultrasonicenzymatic extraction were:ratio of liquid to solid 28∶1，hydrolysis time 1.5h，hydrolysis temperature 45℃，Viscozyme L addition 0.4%，pH 4.0.Under the optimal conditions，the extraction rate of SSPS by using ultrasonic－enzymatic method was 25.92%，which was 14.14%higher than that(11.51%)by only using ultrasonic extraction method.

water soluble soybean polysaccharide;ultrasonic sound;ultrasonic－enzymatic extraction

TS209

B

1002－0306(2011)11－0305－04

2010－10－25 *通訊聯(lián)系人

田瑞紅(1985－)，女，在讀碩士，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(nycytx－004)。