甲殼素超微粉碎輔助制備D-氨基葡萄糖鹽酸鹽

朱興一，張玉燕，謝 捷，王 平

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，制藥工程教育部重點實驗室，浙江杭州 310014)

甲殼素超微粉碎輔助制備D-氨基葡萄糖鹽酸鹽

朱興一，張玉燕，謝 捷，王 平*

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，制藥工程教育部重點實驗室，浙江杭州 310014)

研究了甲殼素超微粉碎輔助制備D－氨基葡萄糖鹽酸鹽(GAH)的工藝。對HCl濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和液料比進行單因素考察，根據(jù)考察結(jié)果進行Box－Benhnken中心組合設(shè)計，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝參數(shù)，然后進行驗證實驗，并將該工藝條件與傳統(tǒng)GAH制備工藝比較。結(jié)果表明，甲殼素超微粉碎輔助制備GAH的較佳工藝為:HCl濃度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反應(yīng)時間3.6h、反應(yīng)溫度83.0℃。此條件下GAH得率為74.82%，與理論值基本相符。與傳統(tǒng)制備工藝相比，新工藝反應(yīng)條件更加溫和，同時GAH得率提高了14.77%。

甲殼素，超微粉碎，D－氨基葡萄糖鹽酸鹽(GAH)，響應(yīng)面分析

甲殼素是一種自然界大量存在的可再生的天然生物高分子聚合物，主要組成單位是N－乙酰－D－氨基葡萄糖。在鹽酸中，甲殼素水解生成D－氨基葡萄糖鹽酸鹽(D－Glucosamine hydrochloride，GAH)。GAH性質(zhì)穩(wěn)定，具有抗炎、抗氧化、防腐、抗菌、抗腫瘤等多種作用，同時也是合成有關(guān)藥物的重要原料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域［1－4］，其需求量日益增加。超微粉碎技術(shù)是為適應(yīng)現(xiàn)代技術(shù)要求而發(fā)展起來的一種新的粉碎技術(shù)，能把原材料加工成微米甚至納米級的微粉。經(jīng)超微粉碎的物料，具有一般顆粒所不具有的特殊理化性質(zhì)，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化學(xué)反應(yīng)活性等［5－7］。超微粉碎技術(shù)被廣泛應(yīng)用到食品、中藥、農(nóng)產(chǎn)品等領(lǐng)域中［8－11］，其發(fā)展前景廣闊。本文探討甲殼素超微粉碎輔助制備GAH的工藝，通過單因素考察和響應(yīng)面分析，確定較佳工藝條件，并與傳統(tǒng)GAH制備方法進行比較，以期提供一種高效制備GAH的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲殼素 片狀，浙江新復(fù)大醫(yī)藥化工有限公司;濃鹽酸、無水乙醇 分析純;粉末狀活性炭 化學(xué)純。

DZF真空干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠; AGO－2型高能行星球磨機 俄羅斯;WZZ－1旋光儀

上海物理光學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 GAH制備工藝

1.2.1.1 甲殼素超微粉碎輔助制備GAH工藝 取甲殼素原料用AGO－2球磨機進行超微粉碎，過500目篩得到粒徑≤0.025mm的超微粉。準(zhǔn)確稱取甲殼素超微粉20.0g，緩慢投入裝有一定濃度HCl溶液的燒瓶中，攪拌條件下緩慢升溫至設(shè)定的溫度，水解反應(yīng)若干小時。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾液用活性炭脫色，再經(jīng)減壓濃縮、無水乙醇洗滌、70℃干燥得GAH白色晶體。計算產(chǎn)品得率，測定旋光度。

1.2.1.2 傳統(tǒng)制備GAH工藝 準(zhǔn)確稱取甲殼素原料

20.0g，緩慢投入裝有一定濃度HCl溶液的燒瓶中，后續(xù)操作過程同前。

1.2.2 GAH得率計算 GAH得率按如下公式計算∶

式中∶m－產(chǎn)品GAH質(zhì)量(g);M－甲殼素質(zhì)量(g)。

1.2.3 旋光度測定 準(zhǔn)確稱取0.25g GAH產(chǎn)品，用蒸餾水配制成25mL溶液，20℃下放置10h后，在WZZ－1旋光儀上測定旋光度，計算其比旋光度。

1.2.4 實驗方案的設(shè)計

1.2.4.1 單因素實驗 通過預(yù)實驗，確定對HCl濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和液料比進行單因素實驗。

1.2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 依據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Design Expert 7.0軟件建立響應(yīng)面分析模型，以HCl濃度(X1)、液料比(X2)、反應(yīng)時間(X3)、反應(yīng)溫度(X4)為自變量，以+1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平，GAH的得率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平實驗。實驗因素與水平的取值見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗及結(jié)果

2.1.1 HCl濃度對GAH得率的影響 固定HCl溶液與甲殼素液料比為4∶1(mL∶g)，反應(yīng)時間為4h，反應(yīng)溫度為90℃，改變HCl濃度，GAH得率見圖1。由圖1可以看出，當(dāng)HCl濃度低于6mol/L時，產(chǎn)品得率較低，這是由于低濃度HCl難以水解β－(1，4)糖苷鍵。隨著HCl濃度的升高，水解能力逐漸增強，GAH得率增加。當(dāng)HCl濃度為8mol/L時，GAH得率最高。HCl濃度繼續(xù)增加時，GAH得率開始下降，這是因為HCl濃度過高，副反應(yīng)增多，焦化現(xiàn)象嚴(yán)重。響應(yīng)面中心組合實驗選取HCl濃度范圍為6～10mol/L。

2.1.2 HCl溶液與甲殼素液料比對GAH得率的影響

固定HCl濃度為8mol/L，反應(yīng)時間為4h，反應(yīng)溫度為90℃，改變HCl溶液與甲殼素的液料比，結(jié)果見圖2。液料比低，反應(yīng)體系黏度增大，反應(yīng)不充分。液料比提高，甲殼素可充分反應(yīng)，但用量過多時會出現(xiàn)副反應(yīng)，GAH得率下降。響應(yīng)面中心組合實驗選取液料比范圍為3∶1～5∶1(mL∶g)。

圖1HCl濃度對GAH得率的影響

圖2 液料比對GAH得率的影響

2.1.3 反應(yīng)時間對GAH得率的影響 固定HCl濃度8mol/L，HCl溶液與甲殼素液料比為4∶1(mL∶g)，反應(yīng)溫度為80℃，改變反應(yīng)時間，結(jié)果見圖3。隨著反應(yīng)時間延長，GAH得率逐漸提高，當(dāng)反應(yīng)達到4h時，得率達到最大值72.23%。時間過短，甲殼素水解不完全，時間過長，副反應(yīng)嚴(yán)重。響應(yīng)面中心組合實驗選取反應(yīng)時間范圍為3～5h。

圖3 反應(yīng)時間對GAH得率的影響

2.1.4 反應(yīng)溫度對GAH得率的影響 固定HCl濃度為8mol/L，HCl與甲殼素液料比為4∶1(mL∶g)，反應(yīng)時間為4h，改變反應(yīng)溫度，GAH得率見圖4。由圖

4可以看出，隨著溫度升高，GAH得率增加，當(dāng)溫度高于80℃時，GAH得率開始下降。溫度較低時，甲殼素不反應(yīng)，溫度過高時，易生成低聚糖與非糖物質(zhì)等副產(chǎn)物，同時產(chǎn)品顏色加深，因而應(yīng)避免高溫，以提高GAH的得率與純度。響應(yīng)面中心組合實驗選取溫度范圍為70～90℃。

圖4 反應(yīng)溫度對GAH得率的影響

2.2 響應(yīng)面分析實驗及結(jié)果

根據(jù)Box－Benhnken實驗設(shè)計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，通過Design Expert 7.0軟件，對制備工藝進行響應(yīng)面分析，建立數(shù)學(xué)模型，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX對自變量進行編碼，共設(shè)立了29個處理組。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長。實驗設(shè)計與實驗結(jié)果如表2所示。各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項回歸方程為∶

表2 Box－Benhnken設(shè)計方案及實驗結(jié)果

當(dāng)“Prob＞F”值小于0.05時表示該指標(biāo)顯著。從表3的分析結(jié)果來看，整體模型“Prob＞F”值小于0.0001，表明該二次方程模型高度顯著。R2=0.9840表明模型響應(yīng)值的變化98.40%來自所選因變量，預(yù)測值與實測值之間具有高度的相關(guān)性。模型的失擬性方差分析可以看出，失擬項不顯著(P＞0.05)，表明該模型是穩(wěn)定的，能很好地預(yù)測實際GAH得率的變化。由表3的F值可知，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，各因素對GAH得率的影響順序為∶HCl濃度＞反應(yīng)溫度＞液料比＞反應(yīng)時間。根據(jù)回歸分析結(jié)果，得到相應(yīng)的曲面圖(圖5～圖10)。圖5～圖10直觀地給出了各個因素交互作用的響應(yīng)面的3D圖和等高線圖。從響應(yīng)面的最高點和等高線圖可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，即是響應(yīng)面的最高點。等高線圖直觀地反映出各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著。比較幾個圖可以知道，HCl濃度、反應(yīng)溫度對響應(yīng)值的影響較大，表現(xiàn)為曲線比較陡，這與回歸分析的結(jié)果吻合。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果驗證

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，甲殼素超微粉碎輔助制備GAH的較佳工藝參數(shù)為∶HCl濃度8.76 mol/L、液料比4.14∶1(mL∶g)、反應(yīng)時間3.55h、反應(yīng)溫度82.9℃。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，對回歸得到的較佳工藝進行驗證實驗。考慮到實際操作的可行性，將較佳工藝條件定為∶HCl濃度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反應(yīng)時間3.6h、反應(yīng)溫度83.0℃。實驗重復(fù)3次，GAH平均得率為74.82%，與預(yù)測值的相對誤差為1%左右。所得產(chǎn)品比旋光度為71.2～72.6°，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求(美國藥典∶+70.0～+73.0°)。由此說明，響應(yīng)面法適用于GAH制備工藝的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化，具有一定的實用價值。

2.4 甲殼素超微粉碎輔助制備工藝與傳統(tǒng)制備工藝比較實驗

對傳統(tǒng)GAH制備進行響應(yīng)面分析法實驗設(shè)計后，得到較佳工藝條件∶HCl濃度10.4 mol/L、液料比4.8∶1(mL∶g)、反應(yīng)時間4.4h、反應(yīng)溫度90.2℃。將此工藝與甲殼素超微粉碎輔助制備的較佳工藝進行比較，結(jié)果見表4。

表4 微粉碎輔助制備工藝與傳統(tǒng)酸法制備工藝比較

由表4可知，與傳統(tǒng)工藝相比，甲殼素超微粉碎輔助制備工藝降低了HCl濃度、用量及反應(yīng)溫度，同時縮短了反應(yīng)時間，GAH得率提高了14.77%，這是

圖5 HCl濃度和液料比對GAH得率影響的響應(yīng)面圖

圖6 HCl濃度和反應(yīng)時間對GAH得率影響的響應(yīng)面圖

圖7 HCl濃度和反應(yīng)溫度對GAH得率影響的響應(yīng)面圖

圖8 液料比和反應(yīng)時間對GAH得率影響的響應(yīng)面圖

圖9 液料比和反應(yīng)溫度GAH得率影響的響應(yīng)面圖甲殼素超微粉碎的特殊作用所致。通過超微粉碎，降低了原料的粉末粒徑，同時增大了表面積，使甲殼素更易于和HCl接觸，從而使反應(yīng)能在較溫和的條件下進行，避免了因長時間高溫作用引起過度反應(yīng)形成的焦化現(xiàn)象，保證了產(chǎn)品的高得率和高純度。

圖10 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對GAH得率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

研究了甲殼素超微粉碎輔助制備GAH的工藝，并用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到較佳工藝參數(shù)∶HCl濃度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反應(yīng)時間3.6h、反應(yīng)溫度83.0℃。此時，GAH的得率為74.82%，與理論值基本相符。與傳統(tǒng)制備工藝相比，新工藝反應(yīng)條件更加溫和，同時GAH得率明顯提高，為GAH生產(chǎn)工藝的改進起到了一定的參考作用。

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Superfine comminution assisted preparation of D－Glucosamine hydrochloride from chitin

ZHU Xing－yi，ZHANG Yu－yan，XIE Jie，WANG Ping*
(College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University of Technology，Key Laboratory of Pharmaceutical Engineering of Ministry of Education，Hangzhou 310014，China)

The operating factors affecting the yield of D－Glucosamine hydrochloride(GAH)from chitin by superfine comminution assisted preparation(SCAP)were studied.Firstly，single factors including HCl concentration，solidliquid ratio，reaction time and reaction temperature were investigated seperately，then the response surface analysis method followed by the verification tests was conducted for obtaining the appropriate operation conditions.Finally，the SCAP method was compared with the traditional preparation method.Results showed that the optimal conditions of GAH preparation were as follow:HCl concentration was 8.8mol/L，liquid－solid ratio was 4.2∶1 (mL∶g)，reaction time was 3.6h and reaction temperature was 83.0℃.Under above conditions，the yield of GAH was 74.82%，which matched with the predicted yield.Compared with the traditional preparation method，the SCAP method had obvious advantages with milder conditions and higher yield.

chitin;superfine comminution;D－Glucosamine hydrochloride(GAH);response surface analysis

TS201.2

B

1002－0306(2011)11－0321－04

2010－09－21 *通訊聯(lián)系人

朱興一(1977－)，男，講師，博士，主要從事天然藥物研究。

浙江省教育廳科研計劃項目(Y200908144);科技部國際科技合作項目(2008DFR40280)。