堿性蛋白酶及其在大豆肽制備中的應用

孫 倩，陳復生，丁長河，劉伯業

(河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州 450052)

堿性蛋白酶及其在大豆肽制備中的應用

孫 倩，陳復生*，丁長河，劉伯業

(河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州 450052)

堿性蛋白酶是一類重要的工業用酶，廣泛應用于食品、醫藥、洗滌劑和皮革等領域。目前食品工業用酶主要來源于微生物，且實際生產中堿性蛋白酶的效果較好。從堿性蛋白酶的產生菌株、結構和性質、應用研究現狀及其在大豆肽制備中的應用等方面進行了概述。

堿性蛋白酶，芽孢桿菌，大豆肽

堿性蛋白酶是在堿性條件下水解蛋白質肽鍵的酶類，是一類非常重要的工業用酶，最早發現于豬胰臟。堿性蛋白酶廣泛存在于動、植物及微生物中。微生物蛋白酶均為胞外酶，不僅具有動植物蛋白酶所具有的全部特性，還有下游技術處理相對簡單、價格低廉、來源廣、菌體易于培養、產量高、高產菌株選育簡單、快速、易于實現工業化生產等諸多優點［1］。1945年瑞士Dr.Jaag等在地衣芽孢桿菌中發現了微生物堿性蛋白酶［2］。1971年Horikoshi首先報導了嗜堿性微生物產堿性蛋白酶的研究［3］。近年來，微生物堿性蛋白酶一直為人們所關注，也是目前研究最為廣泛的酶制劑之一。

1 堿性蛋白酶的產生菌種

食品工業用酶主要來源于微生物，微生物來源的蛋白酶按作用pH可分為三類，即堿性蛋白酶，中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它們的作用最適pH分別為堿性，中性及酸性。這三類酶的活性中心有著明顯的不同∶酸性蛋白酶含有兩個羧基，能為DAN(重氮乙酸正亮氨酸甲酯)失活，不受鰲合劑、巰基試劑或絲氨酸蛋白酶抑制劑的影響;中性蛋白酶的活性中心含金屬離子，常常是 Zn2+，可受到金屬螯合劑EDTA的可逆抑制;堿性蛋白酶的活性中心為絲氨酸，能被二異丙基氟磷酸及苯甲基磺酸氯所抑制。用于實際生產中堿性蛋白酶水解效果較好。多數微生物堿性蛋白酶在pH7～11范圍內有活性。在以酪蛋白為底物時最適pH以9.5±0.5為多，這種酶除水解肽鍵外，還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉酯及轉肽能力。堿性蛋白酶可水解植物、動物蛋白，Alcalase酶可作用于未端疏水氨基酸，使用這種酶可去除蛋白質水解時產生的苦味。來源于Bamyloliguefaciers的堿性蛋白酶可用于制備低變異源性的嬰兒食品，還可用于制備果汁、飲料及治療用人工配制的高蛋白膳食。

利用微生物生產蛋白酶有以下優點∶微生物生長快，適于大量快速培養;培養基成本低;可選用作為工業生產蛋白酶的微生物種類很多，同時又可用遺傳操作手段將其改良;微生物生產的蛋白酶大多數是胞外酶，易于提取。由于這些優點，微生物成為生產堿性蛋白酶的首選材料和重要來源。產堿性蛋白酶的微生物在自然界分布廣泛，主要分離此類微生物的環境有深海、鹽堿湖、沙地等堿性環境。堿性蛋白酶主要產生菌為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、米曲霉、棲土曲霉、灰色鏈霉菌、鐮刀菌等(表1)。目前，商業中應用的堿性蛋白酶主要來源于芽孢桿菌(表2)，如丹麥酶制劑生產商NovoNordisk使用的生產菌株就包括地衣芽孢桿菌［Bacillus licheniformis］，緩慢芽孢桿菌［Bacillus lentus］，其它的堿性蛋白酶商業生產菌株還包括嗜堿性芽孢桿菌［Bacillus alcalophilus(Gist－Brocades，荷蘭)］和枯草桿菌［Bacillus subtilis(Solvay Enzymes，德國)］等。一些革蘭氏陰性菌及真菌等也產生堿性蛋白酶。國內主要有地衣芽孢桿菌2709、地衣芽孢桿菌C1213以及短小芽孢桿菌289和209［4］。

表1 常見產堿性蛋白酶微生物

表2 常見工業生產用堿性蛋白酶產生細菌菌株［5］

2 堿性蛋白酶的結構和性質

Keay按不同pH對蛋白酶作用于酪素的活性曲線，酯酶對蛋白酶活力的比值，免疫學分析中有無交叉反應，以及蛋白酶的氨基酸組成和序列差異，將其分為兩種類型∶A型為Carlsberg型蛋白酶，B型為Novo型蛋白酶［6］。

蛋白酶是催化蛋白質水解成α－氨基酸的酶，不同蛋白酶有不同的活性中心基團，如絲氨酸、半胱氨酸、天門冬氨酸、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+等。大多數微生物堿性蛋白酶的活性中心含有絲氨酸，屬于絲氨酸蛋白酶，其最適作用pH為9～11。遇到作用于絲氨酸的試劑二異丙基氟磷酸(DFP)時失活，是堿性蛋白酶的重要特征。堿性蛋白酶對金屬螯合劑EDTA、重金屬和巰基試劑不敏感，但需要有金屬離子Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等的啟動。Ca2+對堿性蛋白酶有穩定作用［7］。堿性蛋白酶對底物有高度專一性［8］，只能水解蛋白質肽鏈，而不能水解淀粉、脂肪等其它物質，但是有可能水解多種蛋白質堿性蛋白酶作用位點，要求在水解點羧基側具有芳香族或疏水性氨基酸，它比中性蛋白酶水解能力更大而且還具有一定的酯酶活力。

堿性蛋白酶具有信號肽。信號肽的存在是區分胞質蛋白和輸出蛋白的唯一顯著特征。研究發現，在解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)、嗜 熱 脂 肪 芽 孢 桿 菌(B.stearothermophilus)中分泌的中性蛋白酶與在解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliqufaciens)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)中分泌的堿性蛋白酶信號肽段有同源程度很高的保守序列［9］。雷虹［10］等通過設計合適的引物，利用PCR技術從地衣芽孢桿菌2709菌株的染色體DNA中擴增了2709堿性蛋白酶的編碼序列，分析發現地衣芽孢桿菌2709與NCIB6816的堿性蛋白酶的編碼序列只有3%堿基組成差異，與已發表的兩種 Substilisin Carlsberg型氨基酸序列長度一致，同源性為98%～99%。洪揚［11］等研究顯示，2709的堿性蛋白酶信號肽與導肽無論氨基酸序列還是 DNA序列均與NCIB6816完全一致。可見，不同菌株產生的堿性蛋白酶其翻譯加工切除信號肽和導肽的過程及調控機制基本一致。

3 堿性蛋白酶的研究與應用現狀

3.1 國外研究與應用現狀

蛋白酶是工業用酶中占據比例最大的酶類，大約占全世界每年總銷售量的60%左右［12］。當前國外堿性蛋白酶高產菌株的選育主要是用基因工程技術和蛋白質工程手段進行工業微生物菌種的定向選育，目的性強，而且對酶結構的研究也比較深入。Pinar［13］等研究了 pH 對地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)生產堿性蛋白酶的影響。Murat［14］等通過固定化Teredinobacter turnirae細胞生產堿性蛋白酶。Laxman［15］等優化了Conidiobolus coronatus生產堿性蛋白酶的發酵條件，并研究了其擴大培養。Joo［16］等采用Bacillus clausiiI－52經液態發酵生產堿性蛋白酶并將其應用于洗滌劑工業。Ravichandradeng［17］等采用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NCIM－2042經液態發酵生產堿性蛋白酶，研究了發酵罐擴大培養過程中通氣和攪拌對堿性蛋白酶產率的影響。

Anissa Haddar［18］等從Bacillus mojavensisA21中提取了兩種堿性蛋白酶(BM1 and BM2)，通過SDSPAGE得到其分子量分別為29000u和15500u。兩種酶最適pH分別為8.0～10.0和10.0。以酪蛋白作為底物，60℃條件下該酶活性最高。這兩種酶對氧化劑和高pH都具有穩定性，可應用于洗滌劑行業。Qin Yao［19］等利用不同微生物菌種曲霉(Aspergillus sp.)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)和酵母菌(yeast)分別在30℃條件下發酵黑豆，并分析測定了發酵過程中產生的抗氧化成分。研究表明發酵生產可提高黑豆生產中抗氧化物活性和自由基清除活性。Bassem Jaousdi［20］等從一株鏈霉菌菌株中提取和純化了一種熱穩定性堿性蛋白酶，該酶對有機溶劑具有高穩定性，其最適 pH為 11.5，最適溫度為 75℃。Aihua Deng［21］等分離得到一株高酶活的堿性蛋白酶產生菌株芽孢桿菌B001(Bacillus sp.B001)，該菌株對表面活性劑具有高穩定性，最適反應pH為10.0，最適溫度為60℃。隨著研究的深入，極端堿性蛋白酶和高活力堿性蛋白酶工程菌的構建已經成為國外堿性蛋白酶的研究熱點。

3.2 國內研究與應用現狀

我國堿性蛋白酶研究較國外晚，對其研究技術主要有傳統的誘變技術、基因工程、蛋白質工程等。目前我國洗滌行業中加酶洗滌劑占90%以上，且占有率有上升趨勢，堿性蛋白酶的研究發展很快。張晶［22］等從富含蛋白質的土壤中篩選分離得到5株產堿性蛋白酶的菌株，經測定，25℃下各菌株酶活均超過200U/mL，最高達280U/mL。雷曉燕［23］等通過酪蛋白水解圈篩選模型篩選得到一株產堿性蛋白酶活力較強的細菌B1，并對其產酶條件進行了優化。李祖明等［24］采用短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)經紫外誘變育種和固態發酵生產堿性蛋白酶，酶產率可達15300U/g。孫同毅［25］等從土壤中分離出一株產堿性蛋白酶的嗜堿性芽孢桿菌并對其進行了表型分類和16S rDNA序列分析，確定了該菌株的分類學和系統發育學地位。成堃［26］等從土壤中分離出若干株產堿性蛋白酶的菌株，并對其進行了16S rRNA分子鑒定以及酶學性質的初步研究。褚忠志［27］等將短小芽孢桿菌Zkud20224液體的發酵液離心去菌體，用硫酸銨鹽析得粗酶，透析除鹽后進行Sephadex G275柱層析得到電泳純堿性蛋白酶，用該法提純的堿性蛋白酶比活力從粗酶液的 155.5U/mg提高到了954U/mg，回收率為27.6%。該酶水解酪蛋白的最適反應溫度為50℃，最適作用pH為10，且該酶具有較高的熱穩定性和耐堿性。

李祖明［28］等采用5L發酵罐研究短小芽孢桿菌2080產堿性蛋白酶的擴大培養。結果表明，在較優的擴大培養條件下，即空氣流量2.5L/min、空氣壓力0.08MPa和攪拌速度500r/min，短小芽孢桿菌2080堿性蛋白酶的產率較搖瓶水平提高了28%，達到5.17×106U/mL，而發酵時間縮短為42h。孫同毅［29］等采用復合誘變(紫外照射、NTG、離子注入)方法，結合平板初篩與搖瓶復篩育高活力堿性蛋白酶產生菌株，獲得了一株高產突變株HAPN－169，其酶活力為3.5×104U/mL，經中試發酵后酶活達4.2×104U/mL。肖靜［30］等從土壤中篩選獲得1株蛋白酶熱穩定性較好的產堿性蛋白酶芽孢桿菌，該蛋白酶發酵16h達到產酶高峰。

李亞玲［31］等對一株產堿性蛋白酶假絲酵母菌的發酵條件進行了優化，研究各種碳源、氮源及無機鹽對產酶的影響，并應用正交實驗優化發酵培養基組成。那治國［32］等對3株地衣芽孢桿菌產堿性蛋白酶的去酰胺能力和肽鍵水解能力進行了比較，確定了1株去酰胺能力強而肽鍵水解能力弱的菌株，經過紫外誘變，篩選獲得1株產堿性蛋白酶的去酰胺能力有顯著提高的菌株 SDZ－61，去酰胺對達到了27.96%，比誘變前提高了56.6%，而肽鍵水解度基本沒變。

4 堿性蛋白酶在大豆肽制備中的應用

國內外對大豆肽的制備研究主要集中在利用純酶制劑進行直接酶解，但是由于商品酶制劑成本高昂，直接酶解法生產大豆肽代價巨大，限制了其在發展中國家的工業化生產。近年來，微生物發酵法因其原料成本低廉、工藝過程簡便、條件溫和、發酵效率高、多肽質量好等特點日益受到關注。微生物發酵法是利用發酵菌株所產生的蛋白酶，作用于大豆蛋白并將其水解為肽。選擇合適的微生物在以豆粕為主的液體培養基上良好生長，微生物在生長代謝過程中大量分泌胞外蛋白酶和羧肽酶，在發酵過程中可以將大豆蛋白水解并脫除苦味根源的肽鏈末端疏水性氨基酸。

大豆肽的制備工藝中所用的微生物菌株主要集中在產蛋白酶的枯草桿菌1.398、放線菌166、棲土曲霉3.942和黑曲霉3350等。這些菌株具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，尤其蛋白酶有內切酶，酶解能力強，從內部水解大豆蛋白的肽鏈，易形成低分子易被吸收的大豆肽［33］。國外文獻中報導了利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisGR－101(KCCM 10673P))和添加曲霉菌 oryzae GB－107(KCTC 10258BP)來發酵生產大豆肽。美國在74年成立Adle－Nissen領導專門研究水解蛋白課題機構，取得研究成果，Deltown Speciaties公司建成了年產5000t食用蛋白肽的工廠。日本也于80年代開始開展該方面的研究，日本不二制油公司致力于大豆肽的研究，從酶菌選育、水解工藝確定、水解產物脫苦技術及產品分離純化等均取得較大進展，生產出3種大豆肽;日本Kodera Tomohiro等不添加任何脫苦吸附劑或遮蓋劑，直接利用一種內切酶的作用，來切除疏水性末端氨基酸以除去苦味。雪印和森永等乳業公司均已成功地將大豆肽應用于食品工業。

我國近年來在此領域也開展了較多研究。黑龍江省的三樂源集團研制了“大豆蛋白活性肽”，武漢天天好生物制品有限公司在使用復合肽多級定向酶系統技術生產大豆肽方面處于國內領先水平，同時掌握了大豆蛋白肽的性能指針測定、檢測方法以及功能評價等技術。2005年，由山東都慶股份有限公司、中國食品發酵工業研究院組建的注冊資本5000萬元的中食都慶(菏澤)生物技術有限公司，共同投資建設了5000t大豆多功能肽生產線。

我國許多高校等科研機構和人員也進行了這方面的研究開發。萬琦［34］等篩選到一株能在發酵過程中產蛋白酶和外肽酶的枯草芽孢桿菌，利用所產蛋白酶的作用將大豆蛋白水解成短肽，利用所產羧肽酶的作用將短肽末端的疏水性氨基酸切除，實現了酶解和脫苦一步完成的大豆肽發酵生產。劉喚明［35］等用高產蛋白酶的枯草芽孢桿菌進行發酵法生產大豆肽的研究，優化了發酵法制備大豆多肽的生產工藝。劉明［36］等以透明圈法、酶活力方法為指標從12株枯草芽孢桿菌中篩選出4株產酶高、活力強的菌株，并用總抗氧化性為指標進行復篩得到適宜發酵生產大豆抗氧化活性肽的菌種。余勃［37］等利用30L發酵罐發酵豆粕，對微生物法生產大豆多肽的工藝進行了研究。酶活分析表明發酵菌株Bacillus subtilisSHZ3能同時分泌蛋白酶和羧肽酶，分別水解大豆蛋白和肽鏈末端的疏水性氨基酸，使大豆蛋白的水解和多肽的脫苦在發酵過程中一步完成，生產出不苦的大豆多肽。陳宏軍［38］通過發酵實驗對3株芽孢桿菌進行篩選，得到一株發酵豆粕粉效率較高的地衣芽孢桿菌，確定了其發酵條件。經過優化后，發酵液的水解度達到15.9%，比優化前提高了1.92倍，豆粕蛋白水解度也有明顯提高。陳名洪［39］等以脫脂豆粕為原料，具有產蛋白酶能力的菌株CHD21為生產菌株進行發酵。菌株所產蛋白酶作用于豆粕粉中的大豆蛋白將其水解為大豆多肽。實驗以水解度作為指標，對菌株發酵降解豆粕的條件進行了優化。

5 展望

目前，我國微生物堿性蛋白酶的研究已經達到分子水平，高產菌種的選育由傳統單純的使用誘變手段逐步過渡到應用基因工程技術。隨著基因工程的快速發展，越來越多的高溫蛋白酶基因被克隆，堿性蛋白酶結構和功能的關系更加清楚，對酶進行的相關改造將有利于堿性蛋白酶在更多行業發揮重要作用。相信隨著生物技術基礎研究的深入和應用技術手段的完善，堿性蛋白酶的研究和應用范圍必將進一步深入和擴大，具有極大的發展前景。

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Alkaline protease and its application in soybean peptide preparation

SUN Qian，CHEN Fu－sheng*，DING Chang－he，LIU Bo－ye
(School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

Alkaline protease，which is an important kind of industrial enzyme，has been widely applied in food industry，medical treatment，detergent industry，leather producing and other fields.Nowadays，the enzymes for food industry mainly come from microorganism，and the effect of alkaline protease is much better.This article summarizes the producing strains，structure and properties，current use and research status of alkaline protease.Its application in soybean peptide preparation has also been mentioned.

alkaline protease;bacillus;soybean peptide

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)11－0487－05

2010－12－02 *通訊聯系人

孫倩(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品資源開發與利用。

國家自然基金項目(20976037);河南工業大學博士基金項目(2010BS014);2010年河南省高新技術產業化專項基金。