環介導恒溫核酸擴增法的研究和技術方法

李彥媚，趙喜紅，徐澤智，徐振波

(1.廣州醫學院，廣東廣州 510120; 2.武漢工程大學化工與制藥學院綠色化工過程省部共建教育部重點實驗，湖北武漢 430073; 3.南海水產研究所，廣東廣州 510300; 4.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640; 5.美國馬里蘭大學生物醫學科學系，馬里蘭 21201)

環介導恒溫核酸擴增法的研究和技術方法

李彥媚1，趙喜紅2，徐澤智3，徐振波4，5，*

(1.廣州醫學院，廣東廣州 510120; 2.武漢工程大學化工與制藥學院綠色化工過程省部共建教育部重點實驗，湖北武漢 430073; 3.南海水產研究所，廣東廣州 510300; 4.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640; 5.美國馬里蘭大學生物醫學科學系，馬里蘭 21201)

核酸擴增是生命科學領域最具價值的工具之一，在臨床微生物檢測、傳染性疾病以及基因診斷方面具有獨特的應用價值。傳統的檢測方法均存在一定的局限性，因此基于核酸擴增的檢測方法具有廣闊的應用前景。環介導恒溫核酸擴增法(loop－mediated isothermal amplification of DNA，簡稱LAMP)是一種新型的核酸擴增方法，由于其特異性和靈敏度高、簡便快捷且成本低廉，因此在可預見的將來，LAMP技術將在核酸擴增領域逐漸取代PCR反應，推動檢測技術向更快捷簡便，更精確廉價的方向發展。

環介導恒溫核酸擴增法，核酸擴增，臨床檢測

核酸擴增是生命科學領域最具價值的工具之一，在臨床微生物檢測、傳染性疾病以及基因診斷方面具有獨特的應用價值。傳統的檢測方法如常規培養、血清學和免疫學方法(如ELISA)等，均存在一定的局限性，如耗時較長、需要配套的儀器設備、無法解析基因層面的疾病(如對病毒的檢測與分析、分子流行病學研究以及各種基因疾病如SNP的鑒別等)。因此基于核酸擴增的檢測方法具有廣闊的應用前景，主要方法包括∶核酸序列擴增法(nucleic acid sequence－based amplification，NASBA)、自列復制(self－sustained sequence replication，3SR)、鏈置換擴增法(strand displacement amplification，SDA)、聚合酶鏈式反應(Polymerase chain Reaction，PCR)以及熒光定量PCR等。但這些方法均在簡易性、靈敏度、特異性、快速性等方面存在或多或少的缺陷(表1)，因此，開發一種簡易快捷，特異靈敏的核酸擴增檢測方法成為當務之急。2000年，Notomi等開發出一種新的環介導恒溫核酸擴增法(loop－mediated isothermal amplification of DNA，簡稱LAMP)［1］，該方法能夠在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增靶序列。LAMP技術是識別靶目標序列上的6/8個特異區域，設計4/6條引物;在恒溫條件下，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst酶)，通過形成環狀結構及鏈置換，對目標DNA進行大量擴增，形成多種片段的DNA產物。自LAMP方法問世后短短幾年，已被廣泛應用于生物安全、疾病診斷、食品分析及環境監測等領域。該方法在簡便，快速，特異性和靈敏度方面具有顯著優勢，其主要流程為∶選擇靶基因作為檢測對象－LAMP反應的建立及優化－LAMP反應的實際應用。本文將按照LAMP的流程，分別對從實驗設計到應用進行綜述，并著重介紹技術難點及研究經驗。

表1 不同核酸擴增技術的特性比較

1 檢測對象及靶目標基因的選擇

要正確地選擇檢測對象及其靶目標基因，必須對LAMP的特點，包括其優點與缺點有所了解。首先，LAMP反應擴增效率極高，適合用于快速檢測。由于LAMP反應通過形成DNA環與鏈置換，可在恒溫條件下(60～65℃)進行。由于沒有溫度循環過程中的時間損失，因此反應可在短時間內將少量拷貝的靶基因擴增到109～1010水平(DNA濃度約0.4～0.8g/L)。早期的LAMP反應過程耗時約1～2h，但通過對引物進行改進，可明顯提高擴增效率，縮短反應時間;最顯著的進展是通過設計環引物(loop primer)，加速擴增反應的進行，能縮短反應時間至0.5～1h［2］。另外通過優化引物不同的濃度配比，也能提高反應的擴增效率。第二，LAMP反應結果判斷簡易快速。LAMP反應的結果除可以通過常規的凝膠電泳結合成像系統進行檢測外，由于其高效的擴增效率，反應產物極多，因此還有多種通過直接肉眼觀察從而對結果進行判斷的方法，使LAMP反應更方便快捷與簡便。但同時由于反應產物并非均一，因此LAMP的應用也具有其限制性，包括產物無法用于克隆，檢測產物無法進行深入分析與鑒定等。第三，LAMP反應特異性強，靈敏度高，可以取代大多數PCR檢測。由于LAMP的特異引物可以嚴格地識別靶核酸序列上的6個特異區域，通過與該6個獨立部位的準確結合進行擴增反應，因此其特異性極高;即使1個核苷酸差異，LAMP也能夠區分相應的靶序列進行擴增，基于此原理，LAMP可用于SNP的檢測。另外，LAMP反應的靈敏度極高，其靈敏度可達常規PCR的10～100倍(檢出限是常規 PCR的1/100～1/10拷貝數)，因此在對如培養增生耗時長(如結核桿菌)或病毒載量較低(如對病毒攜帶者)等進行檢測時具有較大優勢。同時，與PCR相似，除可直接對DNA進行檢測外，還可以通過逆轉錄(RT)反應，對RNA模板進行檢測，一般稱之為RT－LAMP;這使其可應用于對RNA病毒的檢測。綜上，LAMP在檢測領域內可取代大多數PCR檢測，并獲得更高的特異性與靈敏度。第四，實驗裝置簡單，成本較低廉。由于LAMP反應在恒溫下就可進行，不需要如PCR儀等的溫度循環設備。在LAMP反應實際應用中，僅需要得到穩定熱源的設備，如普通的恒溫儀或水浴鍋即可。因此LAMP方法具有較大的簡易性與推廣價值，尤其適合基層醫療單位和相對落后地區的常規檢測應用。

綜上，LAMP反應具有操作方便，高效快速，靈敏特異和廉價簡易等優點;但同時也具有僅能用于初篩檢測(擴增產物無法用于克隆及深入分析鑒定)和穩定性不高等缺點，因此在選擇檢測對象時需進行全面考慮。

2 保守擴增序列的選擇

在選擇檢測對象及合適的靶基因后，需選取保守的擴增區域，以便進行引物設計。在此對LAMP的引物和反應原理進行闡述。LAMP技術通過識別靶序列上6個特異區域，分別是 F1/B1，F2/B2和F3/B3，設計4條特殊引物。其中兩條為內引物FIP (F1c和F2)和BIP(B1c和B2)，F2和B2分別處于擴增片段兩端，長度為18～24bp;F1/B1分別位于F2/B2內側，與其相距30～40bp，長度與F2/B2相當，為18～24bp。另兩條為外引物F3和B3，分別為位于F2和B2外側，長度為17～21bp，僅在LAMP反應的起始階段起作用。綜上，LAMP引物識別的區域約200～250bp，因此用以設計的擴增區域應至少達500bp以上。LAMP反應過程包括啞鈴狀模板合成階段、循環擴增階段、伸長和再循環階段。首先在啞鈴狀模板合成階段，FIP/BIP的F2/B2序列結合到模板DNA的 F2c/B2c上，通過互補序列配對，合成DNA鏈，形成雙鏈結構。然后，通過F3/B3與模板DNA的F3c/B3c區域互補配對，合成DNA鏈，啟動鏈置換反應，擠掉上述由FIP/BIP合成的DNA鏈，而被釋放出的DNA鏈兩端均存在互補序列，發生自我堿基配對，通過F1c/B1c和F1/B1互補，形成一個環狀結構。這時，被置換下的由FIP/BIP引導的合成鏈兩端自動成環，形成一條兩端環狀的單鏈，即啞鈴結構。其次，在循環擴增階段，上述形成啞鈴結構的通過自我引導延伸，生成雙鏈莖環結構;FIP的F1c結合到莖環DNA環狀結構的F1區域上，合成DNA雙鏈;這時形成了一個過渡性莖環結構DNA，在隨后自我引導的鏈置換DNA合成反應中生成一條莖環DNA和互補的DNA鏈。這兩種結構可通過不斷循環反應生成相同的擴增產物;而其中間產物則為下一階段形成更大片段擴增產物的形成提供模板。最后一步是伸長和再循環階段，FIP/BIP結合到莖環結構的F1/B1上，通過鏈置換反應，不斷合成新的DNA鏈，使莖環個數逐漸增加。LAMP反應的關鍵在于莖環結構的形成與Bst大片段DNA聚合酶作用下的鏈置換，內引物FIP/BIP通過結合到莖環結構環狀區域的互補序列(F1/B1)上，在Bst酶作用下進行不斷的鏈置換反應，最終形成大量不均一的擴增產物，包括上述反應形成一系列反向重復靶序列形成的莖環結構和多環花椰菜樣結構片段，形成大小相差100bp左右的DNA混合物，電泳后形成典型的梯狀圖。

3 引物的設計

LAMP引物的設計是整個反應中最關鍵的步驟。其設計方法包括觀察搜索法與軟件設計法，傳統的設計方法是觀察搜索法，主要基于FIP/BIP中的T－T－T－T序列，在保守擴增序列中找到重復堿基，然后根據引物設計準則進行分析，選擇優化的引物對。成功的引物設計包括如下關鍵因素∶首先，引物間的距離。其中細則包括∶a.成環區，即F2/B2的5'端到B2c/F2c的3'端(外引物F3/B3不參與到主要的環介導擴增反應)，長度約為120～180bp;b.環結合區，即F2/B2的5'端到F1c/B1c的5'端，長度約為40～60bp，其中在F2/B2到F1c/B1c之間的區域可設計環引物LF/LB;c.外引物F3/B3到F2/B2需相隔0～20bp，一般選取12～18bp。第二，Tm值。LAMP引物的退火溫度是引物的重要參數之一，對于反應的起始和延伸過程都非常重要。總的來說為F1c/B1c＞F2/B2＞F3/B3，其中F2/B2，F3/B3和LF/LB的Tm值比較一致，對GC含量比較豐富(GC含量大于65%)的模板可取59～61℃，對 AT含量豐富(GC含量小于65%)的可取54～56℃;F1c和B1c的Tm值稍高，對上述兩種情況分別取64～66℃與59～61℃。第三，引物的穩定性。在引物設計過程中，需注意避免二級結構的產生，尤其是FIP/BIP較長(約40bp)，可采用基因解析軟件進行分析;避免3'末端發夾結構和引物間自身的序列互補(如用Primer Explorer軟件設計，可通過“dimer check”進行確定);末端穩定性對反應的順利進行也十分重要，其中F2/B2，F3/B3和LF/LB的3'端與F1c與B1c的5'端比較重要(如用軟件設計可通過對各引物末端6堿基的dG值進行篩選);相對來說，F3/B3僅在反應啟動階段起作用，其重要性相對較低。第四，GC含量，一般選擇為45%～60%即可。軟件設計法主要是通過榮研公司在線的軟件設計工具，進行LAMP引物設計流程簡述如下∶首先登錄榮研公司在線軟件設計網頁(http∶// primerexplorer.jp/e/)，并選擇軟件版本V3或V 4;輸入模板序列，點擊“Design”，并在系統設別序列后點擊“Generate”生成引物;然后遵循從粗選到細選的規則，在開始的時候可放松挑選的條件，勾選引物，并可點擊“Detail”查看引物的詳細數據;確定所選引物，優先選擇所有5’端和3’dG值小于－4的，另外可選擇2～3組，通過實驗進行進一步篩選;最后點擊“Primer information”進行保存。設計環引物的時候，在引物設計頁面，輸入上述保存的文件，按照相應操作，則可生成環引物。

4 LAMP反應的建立與優化

4.1 引物的篩選與優化

雖然引物經過上述方法進行設計，但最終對引物的篩選，需通過實際LAMP反應進行。因為即使經過嚴格的引物設計程序，并使引物符合所有設定條件，但仍會存在一定的問題，分述如下∶a.擴增結果為陰性;根據我們的經驗，即使通過網上軟件進行設計，并選擇最為優化參數的引物套，但在實際LAMP反應中只有約80%～90%能進行擴增。b.非常規擴增;不同的引物套具有不同的擴增效率，在實際過程中，我們發現同一個LAMP反應體系，不同引物使反應結果達到陽性所需的時間不同;而通過實時濁度計的擴增曲線可見，部分引物為非常規擴增，對此應予剔除。在引物的篩選與優化過程中，建議通過實時濁度計并觀察擴增曲線，在所設計的引物中選擇能特異快速，并符合常規擴增過程的引物套。

4.2 反應體系的優化

LAMP體系對反應具有重要影響，一般常規LAMP體系包括4～6條引物，緩沖液與Bst酶，dNTP，甜菜堿，鎂離子(一般用硫酸鎂)與模板。其中重要的因素包括∶a.反應體系大小∶一般選取25或50μL體系，根據經驗，12.5μL體系仍能成功進行LAMP擴增反應，但穩定性與重現性有所下降。b.引物濃度∶如上述，通過優化引物濃度可有效提高擴增效率。內/外引物的濃度配對比引物的絕對濃度要重要，一般選取4∶1或8∶1。c.dNTP∶與PCR相比，LAMP反應需更高濃度的dNTP，一般終濃度為1～2mmol/L，常用1.4～1.6mmol/L。由于LAMP反應的擴增量是由dNTP決定(而非模板)，因此dNTP的濃度對反應具有重要影響。d.鎂離子∶在LAMP反應過程中需加入鎂離子作為緩沖液，與焦磷酸鹽形成沉淀，維持體系穩定;常用5～10mmol/L的硫酸鎂。e.甜菜堿∶在體系中加入0.5～1mmol/L甜菜堿有利于維持體系平衡，但其并非LAMP反應所必需，根據經驗，即使體系中不加入甜菜堿，LAMP反應也能進行。f.DNA模板∶DNA模板的質量與濃度是反應順利進行的關鍵因素。在體系優化過程中，建議使用質量較高的模板DNA，便于提高反應的穩定性與重現性，從而達到對反應參數的掌握。

4.3 反應參數的評估

LAMP反應的主要參數包括靈敏度和特異性。前者是通過選用不同濃度梯度的模板DNA或檢測對象，獲得LAMP所能檢測的最低檢出值;可用檢測對象(如在細菌中為CFU)或標準DNA量(一般為10～100ng)進行表示。后者則通過在不同種屬的檢測對象中同時設置LAMP反應對照，從而對LAMP反應的特異性進行說明。對陰性對照樣品檢測引物特異性時，需適當把反應時間延長(例如增至120min)，一般如沒有出現陽性結果，則可視為特異;如出現陽性結果，則考慮重新設計引物，甚至更改靶點。

4.4 結果判定

LAMP反應的結果判定包括實時法和終點法。在核酸擴增過程中，隨著dNTP的消耗與擴增產物的合成，同時也形成了大量副產物如焦磷酸鎂鹽沉淀。其化學反應式如下∶

由于LAMP反應極高的擴增效率，因此反應過程中產生了大量的焦磷酸根(可達約10μg)，但PCR反應產生的焦磷酸根則不到0.1μmol/L(約0.2μg)，而常規可檢出的最低濃度是0.5mmol/L(約為4μg)，因此LAMP反應通過焦磷酸鎂沉淀量與DNA生成量之間的線性關系，可對反應進行實時定量，而PCR反應則需要其他特殊的顯色試劑和酶輔助來檢測產生的焦磷酸離子。研究表明，焦磷酸鎂沉淀在400nm處有吸收峰，利用LAMP反應中焦磷酸鎂沉淀與所合成DNA量之間的線性關系，通過實時濁度儀監測沉淀的形成量，對反應中DNA的合成量進行反推，從而對LAMP可進行實時監測和定量［3］。終點法則包括∶a.凝膠電泳∶其中包括直接法和酶切法兩種。由于LAMP反應過程擴增大量的非單一片段的產物，因此可以通過凝膠電泳直接進行檢測;反應過程中形成大量不均一條帶，大小相差100bp左右，在膠上能形成梯狀圖，反映了產物的條帶量;酶切法則可以通過直接利用原有的酶切位點，或在設計引物的時候在TTTT的前后引入酶切位點，通過限制性酶消化來鑒定產物的結構和大小。b.沉淀及熒光判斷法∶其中包括焦磷酸鎂沉淀、鈣黃綠素、Eva Green、SYBR GreenI和HNB等。如上所述，由于LAMP反應過程中形成大量焦磷酸鎂沉淀，因此直接通過肉眼觀察是否生成白色的焦磷酸鎂沉淀，從而對結果進行判斷［1－2，4］。擴增反應結束后，向反應小管中加入(1∶100)的SYBR Green I熒光染料。利用熒光染料SYBR Green I與雙鏈DNA結合會發綠色熒光，因此通過向反應產物加入稀釋的SYBR Green I(1∶100，約1μL)，如反應生成大量的擴增產物，則染料顏色由橙色變為綠色。通過該顏色變化可對結果進行判斷，既可在自然光下肉眼觀察，也可在紫外燈下進行觀察。但由于SYBR Green I能與所有雙鏈DNA進行結合，因此該顏色變化并非LAMP反應特異。而近年來，越來越多的研究報道選用鈣黃綠素作為熒光染料。

綜上，對LAMP反應結果進行判斷有多種方法，可根據實際應用進行選擇。

5 LAMP反應的實際應用

5.1 模板DNA的獲取

模板DNA是LAMP反應順利進行的必要因素之一，在優化反應體系過程中可用質量較高的模板DNA，但在實際應用中，出于降低成本與縮短反應時間，因此更傾向于使用簡易快捷的DNA提取處理方法，從而使模板DNA的質量有所下降;同時，由于DNA處理步驟的減少，因此模板中可能含有大量雜物因子，對LAMP反應的順利進行也會造成一定影響。在實際應用中，需考慮模板DNA的質量問題，在保證LAMP反應穩定性與重現性的前提下，盡量選用簡易快捷的模板提取和處理方法。

5.2 LAMP反應批間穩定性與重現性

如上所述，LAMP的其中一個不足之處是穩定性與重現性較PCR差，與Q－PCR相當。由于LAMP設計過程繁瑣，反應過程復雜，造成其非常規擴增的因素較多，因此其穩定性與重現性較差。但通過優化引物與緩沖液體系，能顯著提高LAMP反應的批間穩定性與重現性;在實際應用中，需至少重復三次反應進行驗證。

5.3 對交叉污染的預防與處理

與所有核酸擴增方法相似，LAMP反應也存在嚴重的交叉污染問題，主要集中于擴增產物的交叉污染。由于LAMP反應擴增效率高和產物量大(比常規PCR高10－3～10－4)，因此非常容易出現產物污染，操作稍不注意就會出現交叉污染，陰性對照也會出現陽性結果;同時出現污染后較難消除，對實驗進程造成較大影響。對交叉污染出現的預防方法最主要是實驗流程的空間隔離，例如按照臨床擴增實驗室標準，把試劑配制，模板處理，擴增反應與結果分析在空間上隔離;其次“不開蓋”原則，即在反應后不打開蓋子進行檢測，主要通過實時濁度儀進行擴增曲線的獲取與分析。在出現交叉污染后，一般對于污染處理的方法包括∶a.改變擴增靶點∶由于LAMP反應產物量大，易于造成污染，使引物以污染的產物為模板進行大量擴增;因此通過改變擴增靶點，重新設計引物，則原污染產物無法被新引物識別，從而消除污染現象。b.消除環境中殘存的LAMP反應產物，主要方法包括∶對環境進行常規清潔和滅菌殺毒等，包括酒精、DNAZAP等;紫外燈照射，但由于紫外線僅對小于500bp的DNA片段起作用，而LAMP反應后能出現大量大于500bp的產物，因此該方法僅能作為輔助用，并不能徹底解決污染;dUTP/UDG系統，通過UDG酶(0.05U)在一定條件下進行消化(37℃，5min)和滅活(92℃，1min)，從而使 dTTP全部為dUTP代替，對低濃度污染(不大于103copies/mL)可進行徹底消除;在一定時期內停止LAMP反應，并注意通風。

6 結語

目前，LAMP反應在食品安全、公共衛生等領域中對常見食源性中毒細菌、流行性病毒、基因診斷等多個方面得到廣泛應用［5－13］。由于其特異性和靈敏度高、簡便快捷且成本低廉，因此在可預見的將來，LAMP技術將在核酸擴增領域逐漸取代PCR反應，推動檢測技術向更快捷簡便，更精確廉價的方向發展。

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Development on the techniques of loop－mediated isothermal amplification

LI Yan－mei1，ZHAO Xi－hong2，XU Ze－zhi3，XU Zhen－bo4，5，*
(1.Guangzhou Medical College，Guangzhou 510120，China;2.Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，China;3.South China Fishery Institute，Guangzhou 510300，China; 4.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China; 5.Department of Microbial Pathogenesis，Dental School，University of Maryland，Baltimore，Maryland 21201，USA)

Clinical detection based on genetic amplification is one of the most valuable tools in bioscience，which had been proved to be applicable in detection of clinical microbes，infectious diseases and gene diagnosis. Limitation on traditional detection methods posed significant obstacles for their broad application.A novel nucleic acid amplification method，designated loop－mediated isothermal amplification(LAMP)，known as a rapid，lowcost，easy operating，highly sensitive and specific detection method，had been reported and applied in the field of bacteriological detection.In future，it’s convinced LAMP will replace PCR assays，contributing to more rapid，simple，specific and accurate detection methods.

loop－mediated isothermal amplification;nucleic acid amplification;clinical detection

TS201.2+4

A

1002－0306(2011)11－0514－05

2010－09－26 *通訊聯系人

李彥媚(1982－)，女，碩士研究生，研究方向:臨床基因檢測。