熒光光度法快速定量大腸桿菌的實驗方法研究

管 驍，農衛良，曹 慧，姚 遠

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093)

熒光光度法快速定量大腸桿菌的實驗方法研究

管 驍，農衛良，曹 慧，姚 遠

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093)

研究比較了菌體滲透處理方式與培養方式對大腸桿菌熒光光度法檢測效果的影響，以及考察了培養條件對熒光強度的影響，結果表明僅采用滲透處理方式處理菌液會造成熒光檢測值偏小，靈敏度偏低;但經LST－MUG(pH7.0)培養液44℃培養7h后的熒光值能對100.9～106.8cells/mL范圍內的大腸桿菌進行定量，結果與國標方法無顯著性差異。該法進一步縮短了大腸桿菌的檢測時間至8h左右，且重現性良好，適合于大腸桿菌的定量檢測。

大腸桿菌，快速檢測，熒光光度法

大腸桿菌是國際公認的環境水質監測和食品安全中的重要指示菌，世界各國也普遍將大腸桿菌作為公共衛生、環境保護和食品安全領域中強制性的檢測內容［1］。目前大腸桿菌的標準定量檢測方法主要以多管發酵法和濾膜法為主，這兩種方法均存在操作繁瑣、檢測周期長等不足，很難適應公共衛生、食品安全事件應急處理與快速反應的需要［2］。基于大腸桿菌細胞內存在特異性β－D－葡糖醛酸糖苷酶(β－D－glucuronidase，GUS)，并能分解4－甲基傘形酮β－D－葡萄糖苷酸(4－Methylumbelliferyl－β－DGlucuronide，MUG)進而產生熒光產物這一原理，國外已成功建立了環境、食品、水體和臨床標本中大腸桿菌的MUG快速檢測方法，并將其作為檢測大腸桿菌的主要方法之一［3－4］。MUG 快速檢測法可將傳統方法6～10d的檢測時間縮短至16～18h以內，并具有特異性強等優點［4］，然而該方法仍存在一些缺陷，如18h左右的檢測時間仍偏長，檢測限仍有待提高等。為進一步推廣該方法的應用，以上缺陷亟需改進，本實驗擬從提高GUS的生成釋放量及酶解底物效率兩個角度出發，分別研究在菌體滲透條件與培養條件下大腸桿菌的熒光檢測結果，以及培養條件對熒光強度的影響，為進一步縮短大腸桿菌熒光定量檢測時間，降低檢測限進行一些探索性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌標準菌株(ACTT－8099) 由中國科學院微生物研究所提供;4－甲基傘形酮(MU)、4－甲基傘形酮－β－D－葡萄糖醛酸苷(MUG) 購自Sigma公司;曲拉通X－100 購自Farco公司。

VersaFluor熒光分光光度計 美國 bio－rad;TOMY SS－325高溫蒸汽滅菌鍋;JY92－Ⅱ超聲波細胞破碎儀;熒光分光光度計 970CRT;PHSJ－4A pH計。

1.2 試劑及培養基配制

MUG溶液:取50mg MUG溶于50m L已滅菌的0.05mol/L PBS緩沖液中(pH=6.5)，避光保存備用。

月桂基硫酸鹽胰蛋白肉湯－MUG(LST－MUG)培養液:32g LST培養基溶于1000m L雙蒸水，121℃滅菌15m in。冷卻后，取1mg/m L MUG溶液25m L加入200m L上述培養基中制得LST－MUG培養基。

脫氧膽酸鈉－MUG(DOC－MUG)培養液:分別稱取胰蛋白胨4.0g，酵母膏3.0g，氯化鈉5.0g，十二烷基硫酸鈉0.1g，脫氧膽酸鈉1.0g，加蒸餾水至1000m L，充分溶解后調pH至7.8，121℃滅菌15min。冷卻后，取1mg/m L MUG溶液25m L加入200m L上述培養基中制得DOC－MUG培養基。

麥康凱培養液:胰蛋白胨20.0g，乳糖10g，氯化鈉5.0g，1%結晶紫0.1m L，溶于1000m L雙蒸水，調pH至7.4，121℃滅菌15m in。冷卻后，加入1%中性紅溶液3～4m L。取1mg/m L MUG溶液25m L加入200m L上述培養基中制得麥康凱－MUG培養基。

LB－MUG培養液:胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉 10.0g，溶于 1000m L雙蒸水，調 pH至 7.0，121℃滅菌15m in。冷卻后，取1mg/m L MUG溶液25m L加入200m L上述培養基中制得LB－MUG培養基。

菌懸液的制備:將大腸桿菌保存菌株接種于營養瓊脂斜面上，37℃培養18h，用生理鹽水稀釋制成不同濃度菌懸液待用。

1.3 實驗方法

1.3.1 大腸桿菌產生熒光光譜分析 將大腸桿菌菌液接入LST－MUG培養液中，同時將不接菌的培養液作為空白對照，然后置于37℃水浴中恒溫培養7h后，用970CRT型熒光分光光度計掃描熒光光譜。另將0.375mg/L 4－甲基傘形酮(MU)標準溶液進行熒光掃描以供光譜比對用。

1.3.2 菌體細胞滲透處理條件下熒光光度法檢測大腸桿菌 為加快釋放大腸桿菌內源性GUS進而酶解底物MUG產生熒光，可對菌體進行滲透處理，包括選用機械裂解(超聲方法等)［7］和化學裂解(曲拉通X－100等)［8］等方法破壞細胞膜，促使大腸桿菌內容物釋放。

1.3.2.1 超聲法處理對熒光強度的影響 取大腸桿菌懸液(約106cells/m L)用超聲細胞破碎儀對菌體細胞進行破碎。破碎在冰浴環境中進行，超聲程序為:200W工作30s，然后間隙60s，共進行8次。取兩份(每份1m L)上述超聲處理過的菌懸液，各加入8m L PBS緩沖液(pH=6.5)與1m L MUG溶液，44℃分別保溫10、20m in，用NaOH調節pH至10.0。以不接菌種的空白溶液作參比，熒光分光光度計激發波長355nm，發射波長450nm處進行檢測。

1.3.2.2 曲拉通X－100處理對熒光強度的影響 取兩份1m L大腸桿菌菌懸液(約106cells/m L)，各加入8m L PBS與1m L MUG溶液，并添加0.1m L曲拉通X－100使最終曲拉通濃度為1%，混勻后在44℃分別保溫10、20m in調pH至10.0，測其熒光強度。

1.3.2.3 超聲結合曲拉通X－100處理對熒光強度的影響 取兩份1m L超聲處理過的菌懸液(約106cells/m L)，各加入8m L PBS與1m L MUG溶液，再添加0.1m L曲拉通X－100使最終曲拉通濃度為1%，混勻后在44℃分別保溫10、20min調pH至10.0，測其熒光強度。

1.3.3 菌體培養條件下熒光光度法檢測大腸桿菌

1.3.3.1 不同培養條件對熒光強度的影響

a.不同培養基對熒光強度的影響 將大腸桿菌菌懸液(1.0×104cells/m L)分別接入DOC－MUG培養液、麥康凱－MUG培養液、LB－MUG培養液和LSTMUG培養液中，同時將對應的不接菌培養液作空白對照，置于37℃恒溫培養，每隔1h測其熒光強度。

b.培養液pH對熒光強度的影響 將大腸桿菌菌懸液接入不同 pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的LST－MUG培養液中，44℃培養，7h后測定培養液的熒光強度。

在另一組實驗中，將大腸桿菌菌懸液接入LSTMUG培養液中，44℃培養7h后，再將培養液的pH調至 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 后測定熒光強度。

c.培養溫度及時間對熒光強度的影響 將大腸桿菌菌懸液接入LST－MUG培養液中，分別置于33、37、40、44、48℃恒溫培養1、3、5、7 和9h 后，將培養液pH調至10.0后，測定培養液熒光強度。

1.3.3.2 菌體培養結合細胞滲透處理對熒光強度的影響 將1m L約104cells/m L濃度的大腸桿菌菌懸液接入9m L LST－MUG培養基中，37℃水浴培養7h后，再按1.3.2中步驟分別進行超聲處理、曲拉通X－100處理以及超聲結合曲拉通X－100處理，將不接菌的LST－MUG培養液作為空白對照檢測其熒光強度。

1.3.4 大腸桿菌接種量與熒光強度的關系 將不同濃度(100～105cells/m L)的大腸桿菌接種于 LSTMUG培養液中(pH7.0～7.2)，44℃培養7h后加入NaOH調pH至10左右，測定熒光強度。同時將對應的菌懸液采用最大可能數法(GB/T4789.38－2008)進行計數，根據實驗結果繪制大腸桿菌總數與熒光強度的對應關系標準曲線。

1.3.5 確證實驗 根據所選定的檢測條件，檢測3份未知濃度的大腸桿菌菌懸液的熒光強度，利用計數標準曲線進行定量，每份樣品平行測定5次。同時采用最大可能數法進行定量，驗證熒光光度法的準確性。數據分析采用STATISTIC 18.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 菌體細胞滲透處理條件下與菌體培養條件下熒光光度法檢測大腸桿菌的對比

MUG本身無熒光特性，但其酶解產物MU是一種熒光物質，用紫外燈照射可產生熒光［5］。本實驗中MU標準品經熒光掃描，證明激發波長和發射波長分別在325及450nm左右;大腸桿菌的LST－MUG培養液經熒光掃描也發現有熒光產生(激發波長和發射波長分別為355及455nm)，但大腸桿菌菌懸液和不接菌的MUG培養液無任何熒光，這說明大腸桿菌在培養過程中產生的酶能分解MUG并產生MU，這是熒光法定量大腸桿菌的理論基礎。其中激發波長發生紅移現象可能是由培養液自身顏色、菌體濁度及其他因素干擾造成的。因此后面的實驗將確定激發波長和發射波長分別為355和450nm。

超聲波具有空化效應，曲拉通X－100則是一種非離子表面活性劑兼熒光增敏劑，這兩種方式均能有效破壞生物膜，從而促使細胞內容物的釋放［6－7］。由圖1結果可知，未進行任何處理的大腸桿菌液與MUG共孵育，在20m in內未見明顯熒光;但經超聲法或曲拉通X－100等處理后熒光明顯，結果如圖1所示，證實了這兩種處理都可使大腸桿菌釋放出內源性β－D－葡萄糖醛酸酶并分解MUG而產生熒光物質。若超聲法與曲拉通同時使用，比單獨使用任一方式的熒光值均略有升高。雖然通過這兩種菌體滲透處理方式能檢測到熒光，并很大程度上縮短了檢測時間(0.5h內就可檢出)，但總體而言檢測效果并不理想，檢測到的熒光值均偏小(低于700)，且測定過程中發現熒光不穩定，測定誤差較大，這可能是由于菌液中大腸桿菌量少，產生的GUS過少且活性不高造成的。

圖1 不同處理條件下的大腸桿菌熒光檢測結果

為進一步增大熒光強度，減小誤差，對大腸桿菌在LST－MUG中進行了7h的培養后檢測熒光值，結果如圖1所示，培養液的熒光強度比不培養顯著增強，由此說明大腸桿菌在培養期間有大量的GUS產生，并能從菌體中釋放出來且活性較高。但在培養基礎上再進行超聲破碎、添加曲拉通等處理與培養后直接檢測熒光強度差異不顯著(最大偏差4.29%)，這說明在菌體培養期間GUS已大量釋放，進一步使用超聲破碎、添加曲拉通等處理對促進GUS的釋放沒有明顯效果，而且培養結合超聲處理的熒光值比培養后直接檢測的還低，由此說明超聲、曲拉通等可能會造成酶的失活以及影響熒光檢測等，所以下一步的實驗采用菌體培養后直接檢測的方法進行，此方法比菌體滲透處理方式更為靈敏，有利于檢測限的降低。

2.2 培養條件對熒光檢測的影響

2.2.1 不同培養基對大腸桿菌生長及熒光強度的影響 考察了四種不同培養液(DOC培養液、麥康凱培養液、LB培養液和LST培養液)分別培養大腸桿菌對熒光強度的影響，結果如圖2所示。從圖中可以看出培養基的選擇對熒光強度有很大影響，培養3h后LST培養液熒光強度顯著增強，DOC培養液和LB培養液也有所增加，但麥康凱培養液幾乎沒有增長;培養5h后LST培養液的熒光強度接近一個高值，進一步延長培養時間熒光強度不再增加，DOC培養液和LB培養液熒光值在5h后也漸趨穩定。在培養5h時對四種培養液中的大腸桿菌數進行了測定，發現LST培養液中菌數達到約4×107cells/m L，其次是DOC培養液(約7×106cells/m L)，麥康凱培養液中菌數(約1.2×106cells/m L)甚至比LB培養液中還大(0.8×106cells/m L)。根據大腸桿菌的生長結果與熒光強度的變化趨勢，說明在不同培養基條件下熒光強度并非和大腸桿菌數量呈嚴格的一一對應關系，同時還會受其他因素的干擾。如麥康凱培養液盡管對大腸桿菌5h的增殖效果比LB培養液更理想，但反映出的熒光強度反而較小，可能是由于麥康凱培養基中的一些成分抑制β－D－葡萄糖醛酸酶的產生與釋放［8］，而大腸桿菌在LST培養液中生長最好，且熒光強度也明顯強于其他幾種培養基，是一種理想的熒光檢測用培養液。

圖2 不同培養基對熒光強度的影響

2.2.2 培養基pH對熒光強度的影響 采用不同pH的LST－MUG培養液培養大腸桿菌后檢測其熒光強度，結果如圖3所示。從圖中可看出，pH低于7時隨pH的升高熒光強度明顯增加，在pH7.0左右熒光強度最高，進一步提高pH熒光強度又急劇降低，這是由于不適當的pH會顯著抑制大腸桿菌的生長，并影響GUS的產生;另外，GUS的最適pH在6.5左右［8］，pH過高或過低會降低酶的活性，甚至失活。

圖3 不同pH條件下培養對熒光強度的影響

大腸桿菌接種到LST－MUG培養液(pH7.0)中培養7h后再調整到不同的pH進行熒光強度的測定，結果如圖4所示。從圖4中可看出，培養液的熒光強度在pH為5～10范圍內明顯發生變化，隨著pH的增加而上升;當pH＞10時，熒光強度趨于穩定。由此可知熒光產物MU在堿性條件下有較強熒光，因此菌體培養結束后可通過提高培養液的pH來增強熒光強度，進而提高檢測靈敏度，這與Maddocks［8］等人的研究結果類似。由此可見，采用pH為7.0的LST培養基對大腸桿菌進行培養，待培養結束后，再調整pH至10進行熒光強度檢測是較好的操作條件。

圖4 pH對熒光強度測定的影響

2.2.3 培養溫度及時間對熒光強度的影響 大腸桿菌的生長溫度為10～45℃，最適溫度為37℃［9］。大腸桿菌在LST－MUG培養液中進行不同溫度的培養，熒光強度變化如圖5所示。由圖5可看出，在33與37℃的培養條件下熒光強度在4h內快速增加，超過4h后趨于穩定;而在40℃下培養，其熒光值明顯偏低;44℃培養時，培養液熒光強度不斷增加，7h左右達到穩定且強度超過33與37℃的高值;48℃下培養液基本無熒光現象。出現這種現象的可能原因是:溫度不僅關系著大腸桿菌的生長狀況，進而影響GUS的生成與釋放量，同時還關系到GUS對MUG的酶解作用，因此對熒光強度影響較大。44℃盡管不是大腸桿菌的最適生長溫度，但此溫度可能更有利于GUS從大腸桿菌中的釋放，以及GUS在此溫度下能表現出高活性［10－11］，MUG 被分解得最徹底，熒光強度故而最大。由此可見采用44℃培養是最佳反應條件。

圖5 培養溫度對熒光強度的影響

2.3 大腸桿菌接種量與熒光強度的關系

為確證在優化的實驗條件下熒光光度法定量檢測大腸桿菌的可行性，對大腸桿菌接種量與熒光強度的對應關系進行了實驗，結果如圖6所示。在100.9～106.8cells/m L的菌濃范圍內，熒光強度與大腸桿菌接種量表現出良好的線性關系Y=731.03 lgX－783.69(R2=0.9567);若接種量在 102.5～105.5cells/m L范圍內，兩者的線性關系進一步提高(R2=0.9893，數據未顯示)，說明在本實驗確定的最優檢測條件下，熒光強度大小與大腸桿菌呈一一對應關系，因此采用熒光光度法對大腸桿菌進行定量是完全可行的。

2.4 確證實驗

圖6 大腸桿菌接種量與熒光強度的關系

分別采用熒光光度法和最大可能數法(GB/T4789.38－2008)對三份未知濃度的大腸桿菌菌懸液進行定量測定，結果如表1所示。三份樣品的測定結果表明，兩種測定方法之間無顯著性差異，且熒光光度法平行測定的相對標準偏差最大為27.1%，低于最大可能數法的31.4%，表明熒光光度法在大腸桿菌的快速定量中準確度與精度均較高，結果可信。

表1 熒光光度法與最大可能數法定量結果比較

3 結論

根據本實驗分析結果可知，大腸桿菌在超聲處理或曲拉通X－100等滲透處理條件下均可釋放出GUS并分解MUG產生熒光，但熒光效應偏弱，誤差較大，無法滿足常規的大腸桿菌定量要求。而將菌體進行培養后再檢測能很好解決這一問題，最佳操作條件為:采用pH為7.0的LST－MUG培養基在44℃對菌體培養7h后，調整pH至10，此時培養液的熒光強度與大腸桿菌接種量(100.9～106.8cells/m L范圍內)呈良好的線性關系。該處理條件進一步縮短了檢測時間，包括前處理及測定步驟整個過程約8h，最低檢測限降至100.9cells/m L。當然，由于本次實驗采用的是標準大腸桿菌菌懸液為測試樣本，干擾因素較少取得了理想的效果，但對組成復雜的環境或食品測試樣本效果如何以及可行的解決措施，有待于下一步的研究。

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Study on the rapid enumeration of Escherichia coli with fluorescent method

GUAN Xiao，NONG Wei－liang，CAO Hui，YAO Yuan
(School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai200093，China)

The effect of osmotic treatment and culture on the detection of E.coli with fluorescent method were discussed respectively，and the effect of culture conditions on fluorescent intensity also investigated.The results indicated that only osmotic treatment for E.coli would cause small fluorescent intensity and low detection sensitivity.However，fluorescent intensity obtained under the conditions of cultured for 7h at 44℃ in the LST－MUG culture medium could quantified the E.coli in the range of 100.9～106.8cells/m L，and the results obtained by this method and standard method showed no significant difference.Optimized fluorescent method shortened the detection time to 8h，and showed good reproducibility.Therefore，the method described is applicable to the rap id enumeration of E.coli.

Escherichia coli;rapid detection;fluorescence method

TS207.4

A

1002－0306(2011)09－0403－05

2010－09－20

管驍(1979－)，男，博士，講師，研究方向:食品安全快速檢測。

上海市聯盟計劃項目(09LM42);上海市研究生創新基金項目(JWCXSL0902);上海市松江區博士后創新基地項目。