內(nèi)源乳化法制備溶菌酶微膠囊的研究

劉若男，李俊華，楊嚴俊，*

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫 214122;

2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

內(nèi)源乳化法制備溶菌酶微膠囊的研究

劉若男1，李俊華2，楊嚴俊1，*

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫 214122;

2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

研究了殼聚糖－海藻酸鈉內(nèi)源乳化法制備溶菌酶微膠囊的工藝條件。海藻酸鈉濃度2.0%，溶菌酶濃度1.5%，殼聚糖濃度為0.3%，Span 80的添加量為油相體積的1.0%時，正交實驗得出最佳制備條件為:碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為7∶40，水相與油相體積比為30∶70，冰醋酸與碳酸鈣質(zhì)量比為1.4∶1。然后，研究了溶菌酶微膠囊的粒徑分布以及在模擬胃腸液中的控制釋放效果和包埋后的溶菌酶在模擬胃液中的穩(wěn)定性。結果表明，微膠囊粒徑大小為483.7μm，粒徑分布指數(shù)為0.6;優(yōu)化得到的微膠囊在模擬胃液中2h釋放率為35.5%，在模擬腸液4h后總釋放率達88.9%;模擬胃液處理后溶菌酶保留活性達90.0%。

海藻酸鈉，殼聚糖，內(nèi)源乳化，溶菌酶

溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)又稱細胞壁質(zhì)酶(Muram idase)或 N－乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N－acetylmuramide glycano－h(huán)ydralase)［1］。溶菌酶以溶解革蘭氏陰性菌及革蘭式陽性菌的細胞壁而具有溶菌作用。溶菌酶本身是一種無毒、無害、安全性很高的高鹽基蛋白，具有抗菌、消炎、抗病毒、增強機體免疫力等作用。該酶與甘氨酸和聚合磷酸鹽等配合使用，具有良好的防腐作用。其被添加到奶粉中不僅具有防腐作用，而且還有提高免疫力的作用。同時，溶菌酶對仔豬腹瀉有防治作用，它與免疫球蛋白在功能上有著緊密的聯(lián)系，并能與其他生命活性物質(zhì)共同增強抗體的活性，從而殺滅細菌。溶菌酶作為添加劑添加至產(chǎn)品中時，光、氧、溫度、pH等均會對溶菌酶的活力造成一定的影響，進而影響其加工貯存性。更重要的是，溶菌酶常被用于在腸道抗菌，但當其在消化道內(nèi)處于胃液環(huán)境時，由于強酸性環(huán)境和胃蛋白酶的分解，溶菌酶的活性損失較大。所以，為了使溶菌酶在腸道內(nèi)充分發(fā)揮其生理功能，本文采用常用的腸溶性壁材殼聚糖－海藻酸鈉［2－3］，研究了內(nèi)源乳化法制備溶菌酶微膠囊的工藝，優(yōu)化得出最佳工藝條件，并進一步考察了微膠囊在模擬胃腸液中的釋放效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海藻酸鈉 粘度10g/L，20℃/Pa·s≥0.02，國藥集團化學試劑有限公司;殼聚糖 分子量570kDa，脫乙酰度80%，大連鑫蝶甲殼素有限公司;溶菌酶 康德生物科技有限公司;溶壁微膠囊菌 上海天呈科技有限公司;胃蛋白酶 活力1∶10000，Sigma公司。

RW 20 digital機械攪拌機 IKA公司;UV－2000可見光分光光度計 Unico公司;Mastersizer2000激光粒度儀 英國馬爾文公司。

1.2 溶菌酶微膠囊的制備

采用二步內(nèi)源乳化法制備海藻酸鈉－殼聚糖溶菌酶微膠囊，基本工藝:2.0%(W/V)海藻酸鈉溶液，依次加入碳酸鈣，1.5%(W/V)的溶菌酶。400 r/m in機械攪拌，加入石蠟油(含一定量的Span80)，乳化15m in后加入20m L含有冰醋酸的石蠟油，攪拌1h。4℃靜置2～4h后，將上層油相倒出，用pH4.5醋酸緩沖液洗滌膠囊，直到無殘留油相。最后用0.3%的殼聚糖溶液包衣30m in，冷凍干燥得到溶菌酶微膠囊。

1.3 微膠囊的特性檢測1.3.1 包封率及載藥量的測定［4］準確稱取10.0mg凍干微膠囊，加入10.0m L pH8.0的磷酸鹽緩沖液，37℃下攪拌2h，微膠囊完全溶解后，4500 r/m in離心10m in，考馬斯亮藍法測定離心后上清液的蛋白質(zhì)濃度。微膠囊包封率的計算公式如下:

1.3.2 體外模擬胃腸液中釋放率的檢測［5］準確稱取10.0mg微膠囊凍干粉，置于50m L具塞錐形瓶中，加入不含胃蛋白酶的模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)10m L，在恒溫搖床中于 37℃、100 r/m in 振搖2h。然后將微膠囊過濾，轉移至10m L不含胰蛋白酶的模擬腸液中，定點取樣(同時補充等量同溫介質(zhì))。樣液于4500 r/m in離心10min，測定上清液中蛋白質(zhì)的濃度，方法同上。根據(jù)以下公式計算:

式中，Cn:第n個時間點所取樣品濃度;V:釋放介質(zhì)總體積;Vi:第i個時間點的取樣體積;Ci:第i個時間點所取樣品濃度(V0及C0均為零);W:溶菌酶微膠囊的重量。

1.3.3 微膠囊穩(wěn)定性的測定［5］將微膠囊凍干粉10.0mg置于50m L具塞錐形瓶中，加入模擬胃液SGF(微膠囊∶模擬胃液 =1∶20)，在恒溫搖床上37℃、100 r/m in下振搖2h。然后將微膠囊過濾，加入破囊溶液5m L，在恒溫搖床上在37℃，100 r/m in下振搖2h。完全溶解后，樣液于4500 r/m in離心10min，測定上清液中蛋白的濃度及溶菌酶的保留活性。表示為:1.3.4 溶菌酶活性的測定［6］溶菌酶的比酶活以水解溶壁微膠囊菌(Micrococcuslysodeikticus)的速度恒量。步驟如下:

首先，配制pH6.24，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。將一定量的溶壁微膠囊菌菌懸液用pH6.24的磷酸鹽緩沖液稀釋，在450nm下，使其吸光度值達到0.8左右。溶菌酶底物溶液于25℃水浴中保溫，用1cm比色皿裝2.5m L底物于水浴中，加入0.5m L酶液開始計時，記下反應1m in時的讀數(shù)E1以及反應2m in時的讀數(shù)E2，用以下公式計算酶活:

式中:ΔE450:450nm處每 min吸光度的變化;Ew:每0.5m L所用酶溶液中含有酶的重量，mg;0.001:一個單位在每分鐘內(nèi)使吸光度下降0.001。

2 結果與討論

2.1 碳酸鈣添加量對微膠囊包封率及載藥量的影響

選取水相與油相體積比為30∶70，冰醋酸與碳酸鈣質(zhì)量比為1.4∶1，表面活性劑添加量為油相體積的1.0%，考察碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為 4∶40、7∶40、10∶40、15∶40、25∶40 對微膠囊質(zhì)量的影響。

由圖1可看出，碳酸鈣與海藻酸鈉的質(zhì)量比在7∶40時，包封率較高，載藥量較大。這主要是因為，Ca2+濃度過低，不足以形成海藻酸鈣微膠囊;Ca2+濃度過高，凝膠收縮程度加強，因而包封率降低。

植物材料：橡膠草植株于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖邊，后移栽至石河子大學農(nóng)業(yè)科學重點實驗室進行室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（20±3）℃，光照強度為2 000 Lx。

圖1 碳酸鈣添加量對微膠囊包封率及載藥量的影響

2.2 水相與油相體積比對微膠囊包封率及載藥量的影響

選取碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為7∶40，冰醋酸與碳酸鈣質(zhì)量比1.4∶1，表面活性劑添加量為油相體積的是1%，考察了油相比例為30%、40%、50%、60%、70%對微膠囊質(zhì)量的影響。

由圖2可以看出，油相比例的變化對微膠囊包封率及載藥量的影響相對比較明顯。隨著油相比例的增加，溶菌酶微膠囊的包封率及載藥量都是增加的，故油相比例為70%最佳。如果油相比例過低，如30%時，包封率比較低，可能是由于油相較少，乳化不夠充分，導致包封率較小。

2.3 冰醋酸添加量對微膠囊包封率及載藥量的影響

選取碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為7∶40，水相與油相體積比為30∶70，表面活性劑添加量為油相體積的1%，考察了冰醋酸與碳酸鈣質(zhì)量比為0.2∶1、

圖2 水相與油相體積比對微膠囊包封率及載藥量的影響0.6∶1、1.0∶1、1.4∶1 對微膠囊質(zhì)量的影響。

由圖3可看出，微膠囊包封率及載藥量隨著冰醋酸添加量的增加而升高。冰醋酸與碳酸鈣之間為每分子碳酸鈣與2分子冰醋酸反應［7］。當冰醋酸添加量較少時，溶解加入到海藻酸鈉溶液中的碳酸鈣低于化學計量比例。但當冰醋酸添加量繼續(xù)增加時，包封率及載藥量增加不是很明顯，這主要是因為在后續(xù)工藝中，用pH4.5醋酸緩沖液洗滌微膠囊時，可以進一步溶解微膠囊內(nèi)部沒有溶解的碳酸鈣，使冰醋酸與碳酸鈣的比例對包封率和載藥量的影響不是很大。

圖3 冰醋酸添加量對微膠囊包封率及載藥量的影響

2.4 Span80添加量對微膠囊包封率及載藥量的影響

選取碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為7∶40，水相與油相體積比為30∶70，冰醋酸與碳酸鈣質(zhì)量比1.4∶1，考察了表面活性劑添加量為油相體積的0、1%、2%時對微膠囊質(zhì)量的影響。

由圖4可以看出，表面活性劑的添加量對微膠囊的包封率及載藥量影響甚微。但在實驗中觀察到，未添加Span80的微膠囊在體系中結團較為嚴重，粒徑較大。而添加量為1%與2%時，觀察到乳化體系穩(wěn)定，粒徑較小，最終選擇Span80添加量為油相體積的1%。

圖4 Span80添加量對微膠囊包封率及載藥量的影響

2.5 正交實驗確定最佳工藝條件

為確定溶菌酶膠囊制備的最佳條件，以碳酸鈣加入量、油相比例及冰醋酸加入量為主要考察因素，以微膠囊包封率和載藥量為考察指標進行正交實驗，結果如表2所示。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗設計與結果

由表2可知，三個因素的主次順序為油相比例(B)＞碳酸鈣添加量(A)＞冰醋酸添加量(C)。最佳工藝組合為A2B1C3，即碳酸鈣添加量碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為7∶40，水相與油相體積比為30∶70，冰醋酸與碳酸鈣質(zhì)量比為1.4∶1，此條件下實驗制得的微膠囊包封率為89.9%，載藥量為34.9%。

2.6 溶菌酶微膠囊特性研究

2.6.1 溶菌酶微膠囊的粒徑分布 用Mastersizer 2000測定微膠囊粒徑，結果如表3所示，其中粒徑分布指數(shù)較小，說明制備的溶菌酶微膠囊大小較為均一。

圖5 溶菌酶微膠囊的粒徑分布

表3 溶菌酶微膠囊粒徑測定結果

2.6.2 溶菌酶微膠囊胃腸內(nèi)釋放效果 由圖6可以看出，用殼聚糖－海藻酸鈉為壁材制備的溶菌酶，前2h在模擬胃液中釋放率較低，后續(xù)在模擬腸液中，2h至3h之間有一突釋過程，3h至6h緩慢釋放，最終總釋放率高達近90%。該微膠囊胃液中的低釋放率和經(jīng)過胃腸道后的高總釋放率使溶菌酶在腸道內(nèi)可以充分發(fā)揮其生理功能。

圖6 溶菌酶微膠囊在模擬胃腸液內(nèi)的釋放

2.6.3 包埋后的溶菌酶經(jīng)過人工模擬胃液后的活性研究 由表4可知，在模擬胃液中2h后，未包埋的溶菌酶活性只保留31.7%，而包埋后的溶菌酶活性能夠保留90.0%。這說明，制備的溶菌酶微膠囊不僅可以使溶菌酶較少地在胃液中釋放，同時還能大大降低胃液對未釋放的溶菌酶活性的影響。

表4 包埋對溶菌酶活性的影響

3 結論

3.1 海藻酸鈉濃度2%，溶菌酶濃度1.5%，殼聚糖濃度0.3%，Span 80的添加量為油相的1%時，內(nèi)源乳化法制備溶菌酶微膠囊的最佳工藝條件為碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為7∶40，水相與油相體積比為30∶70，冰醋酸與碳酸鈣質(zhì)量比為 1.4∶1。

3.2 通過對溶菌酶微膠囊的性質(zhì)檢測，結果顯示:溶菌酶微膠囊平均粒徑為483.7μm，粒徑分布指數(shù)為0.6;溶菌酶微膠囊經(jīng)過模擬胃液2h后，膠囊釋放率35.5%，在胃液中未釋放的溶菌酶經(jīng)過胃液后，能夠保留90.0%的活性;經(jīng)過模擬腸液4h后，膠囊總釋放率達88.9%。

［1］林向陽.溶菌酶及其應用研究［J］.中國食品添加劑，2005(6):104－106.

［2］許時嬰.微膠囊技術［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2006.

［3］Meera George.Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs:Alginate and chitosan—a review［J］.Journal of Controlled Release，2006，114:1－14.

［4］Hari PR，Chandy T，Sharma CP.Chitosan/calcium alginate microcapsules for intestinal delivery of nitrofurantoin［J］.Journal of Microencapsulation，1996，13(3):319－329.

［5］Kovvacs－Nolan J，Mine Y.Microencapsulation for the gastric passage and controlled intestinal release of immunoglobulin Y［J］.Journal of Immunological Methods，2005，296(1 －2):199－209.

［6］趙玉萍.溶菌酶測定方法的改進［J］.食品科技，2002(1):58－59.

［7］Catarina mSilva.Alginatemicrospheres prepared by internal gelation:Development and effect on insulin stability［J］.International Journal of Pharmaceutics，2006，311:1－10.

Study on the microcapsule of lysozyme prepared by internal emulsification method

LIU Ruo－nan1，LI Jun－h(huán)ua2，YANG Yan－jun1，*
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China;
2.School of Food Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

The preparation technique of microcapsule from chitosan－alginate sodium was investigated.When the concentration of alginate sodium，chitosan and lysozyme were 2.0%，0.3%，1.5%respectively，and the volume ratio of Span80 to oil was 1.0%，the results from orthogonalexperiments were that the mass ration of CaCO3to alginate sodium was 7∶40，and the ratio of water to oil was 30∶70，and，and the mass ratio of glacial acetic acid to CaCO3was 1.4∶1.Then the size distribution of microencapsulation and the control－release property of the microcapsule of chitosan－alginate sodium in imitated stomach－liquid environment and the activity of embedded lysozyme in the imitated stomach－liquid were determined.The results showed that the size and SPAN factor of microencapsulation were 483.7μm and 0.6 respectively，the release ratio in imitated stomach－liquid after 2h was 35.5%，and the whole release ratio in imitated liquid after 4h was 88.9%，the activity of embedded lysozyme in the imitated stomachliquid was 90.0%。

alginate sodium;chitosan;internal gelation;lysozyme

TS201.2+5

B

1002－0306(2011)08－0318－04

2010－08－18 *通訊聯(lián)系人

劉若男(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物化學。