乳糖誘導基因工程菌產β-葡聚糖酶及其酶學特性的研究

戴易興，王洪新，呂文平，孫軍濤，秦曉娟

(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

乳糖誘導基因工程菌產β-葡聚糖酶及其酶學特性的研究

戴易興，王洪新，呂文平*，孫軍濤，秦曉娟

(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

考察了乳糖替代IPTG誘導重組大腸桿菌產β－葡聚糖酶的可行性，分別對乳糖作為誘導劑時的終濃度、誘導時機、誘導時間和溫度等方面進行了研究。結果表明，工程菌培養6h(OD600達到0.7左右)后，加入終濃度為10mmol/L的α－乳糖，升溫至41℃，誘導6h，酶活可達到830.7U/mL。與IPTG相比，酶活提高2倍左右，發酵周期縮短70%。該酶pH穩定范圍較寬，熱穩定性良好，在生理溫度(70℃左右)下活性高，說明乳糖可以作為基因工程菌的高效誘導劑。關鍵詞:基因工程菌，β－葡聚糖酶，乳糖，IPTG，酶學特性

β－1，3－1，4－葡聚糖酶(EC3.2.1.73，以下簡稱β－葡聚糖酶)是一種內切水解酶，主要來源于微生物，專一催化大麥β－葡聚糖或地衣多糖中臨近β－1，3和 β－1，4糖苷鍵的水解反應。β－葡聚糖酶應用于啤酒生產中，可以分解大麥及麥芽中的β－葡聚糖凝膠，改善啤酒的混濁度，提高產品質量［1］;應用于制糖業中，可防治高粘性葡聚糖的形成，提高制糖業的提取率［2］;應用于飼料中，可以消除β－葡聚糖的抗營養作用，提高飼料的消化率，改善畜禽生產性能［3］。近年來，構建質粒含有T7啟動子的基因工程菌，用于高效表達β－葡聚糖酶的技術已經逐漸得到應用。以往大多采用IPTG(異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷)作為工程菌的誘導劑，鑒于其昂貴的價格和潛在的毒性，低廉無毒的乳糖已經逐漸替代IPTG成為一種新的誘導劑。有文獻報道［4］結合乳糖和IPTG協同誘導，更易實現β－葡聚糖酶的高效表達，也有研究者［5］采用含有乳糖的乳清粉作為培養基成分，大幅提高了發酵所得β－葡聚糖酶的活力。本研究室構建的重組大腸桿菌E.coliBL21，產酶量大，耐熱性好，是生產β－葡聚糖酶的優良菌株。本研究在前期優化了適合該菌株產酶的最適半合成培養基的基礎上，比較了IPTG和α－乳糖兩種誘導劑發酵產β－葡聚糖酶的效果，確定了最佳誘導條件，并考察了所產酶的酶學特性，為該酶的工業化生產提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β－葡聚糖酶基因工程菌(E.coliBL21) 由本實驗室構建和保存;種子培養基(g/L) 胰蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，pH 7.0;發酵培養基(g/L) 麩皮6.7，玉米粉1.7，豆粕13.8，豆粉13.8，酵母粉7.0，NH4Cl7.0，Na2HPO4·12H2O3.0，MgSO4·7H2O 0.75，CaCl20.5，吐溫80 0.8%，自然pH，抗生素。

超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司;氣浴恒溫搖床 金壇市瑞華儀器有限公司;UV－2100分光光度計 尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 重組大腸桿菌E.coliBL21，在30mL種子培養基中，37℃ 200r/min搖床培養至OD600達到1.0左右。吸取300μL至裝有30mL發酵培養基的250mL錐形瓶中，37℃ 200r/min搖床振蕩過夜，分別采用IPTG和α－乳糖兩種誘導劑，在不同濃度下進行誘導。

1.2.2 β－葡聚糖酶酶活的測定 樣品處理參照文獻［6］;酶活測定參照文獻［7］;酶活力單位定義:1mL酶液在70℃和pH7.6條件下，1min水解底物生成1μg還原糖(以葡萄糖計)的量為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.3 菌體密度測定 適當稀釋菌液于600nm下測吸光度，所得值和稀釋倍數的乘積即菌體密度OD600。1.2.4 目的蛋白表達量的測定 10%SDS－PAGE圖譜經掃描，用凝膠分析系統分析測定表達產物占菌體總蛋白的含量。

1.2.5 菌體生長曲線的測定 分別向若干裝有30mL LB培養基的250mL三角瓶中接入300μL一級種子液，37℃ 200r/min搖床培養，每隔1h取出一瓶，測定菌液在600nm下的OD600值。

2 結果與討論

2.1 菌體生長曲線的測定

按照1.2.5的方法，測定二級種子液的生長曲線。由圖1可知，菌種在0～1h以內，處于停滯期，1h后迅速進入對數生長期，6h后處于穩定期，10h后菌體生長進入衰退期。發酵菌種的種齡以對數生長中后期為宜，種齡過低菌株的其密度也低，整個發酵周期會延長，產物表達量降低。過老的種子雖然菌量較多，但接種后會導致生產能力的下降，菌體過早衰退［8］。因此我們選取OD600在1.0左右的菌種作為二級種子液。

圖1 重組大腸桿菌的生長曲線

2.2 誘導劑及其濃度對產酶的影響

國外已有大量研究表明［9－11］，乳糖可以作為重組大腸桿菌的良好誘導劑。但國內研究［12－13］報道，雖然乳糖誘導對于菌體的生長有一定的促進作用，但它的誘導表達速度比IPTG慢，目的蛋白表達量不及IPTG。

采用1.2.1的方法，使IPTG終濃度分別達到0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.6、9.2mmol/L，α－乳糖的終濃度分別為2、4、6、8、10、12、14mmol/L。由結果可知，獲得最高酶活的IPTG終濃度為3.2mmol/L，α－乳糖終濃度為10mmol/L，但α－乳糖作為誘導劑所獲得的酶活普遍高于IPTG(圖2)。乳糖作為誘導劑時獲得的最大酶活，較IPTG為誘導劑下的酶活提高了近40%，表明可以考慮乳糖作為IPTG的替代品。這可能是由于乳糖同時起到了誘導劑和碳源的作用［14］，在菌體過夜生長將碳源基本耗盡時，添加乳糖相當于進行補料，可再次提高菌體的生長速度和對目的蛋白的表達，而且使產物可溶性升高［15］。

圖2 誘導劑及其濃度對菌體產酶的影響

2.3 誘導時機對產酶的影響

當菌體培養時間分別達到 2、3、4、5、6、7、8h 時，添加終濃度為10mmol/L的乳糖作為誘導劑。由圖3可知，當菌體培養6h，即菌體密度達到OD600=0.7左右時，進行誘導所得的酶活最高。這是由于培養時間較短，菌體生物量會偏低，產酶能力較差;培養時間過長，菌體則可能進入衰退階段，產生自溶現象，嚴重影響產酶。

圖3 誘導時機對菌體產酶的影響

2.4 誘導時間對產酶的影響

菌體培養6h后加入終濃度為10mmol/L的乳糖，誘導時間分別為 1、2、4、6、8、10、20、22、24、26h。結果顯示，誘導時間達到20h時所產酶酶活最高(圖4)。但考慮到工業生產的績效，我們選擇誘導時間為6h，此時所得酶活較誘導20h的低10.39%，但發酵時間縮短了70%，可以明顯加快發酵產酶速度，提高效率，增大產量。

圖4 誘導時間對菌體產酶的影響

2.5 誘導溫度對產酶的影響

溫度是影響菌體生長和表達的重要因素。由于菌種的最適生長溫度和最適表達溫度不同，因此在不同階段應該選擇不同的溫度，采用變溫發酵方式［16］。

菌體在37℃培養6h后，添加終濃度為10mmol/L的乳糖，同時將溫度分別調節到 31、33、35、37、39、41、43℃，誘導6h。結果顯示，當誘導階段的溫度達到41℃時所產酶酶活最高(圖5)。誘導溫度低于35℃時，對酶活的負面影響顯著，可能是由于低溫會使營養物的攝入和生長速率降低，攝氧速度降低。在41℃以上繼續升溫，卻不再表現出提高酶活的作用，這是因為高溫雖有利于提高生物量，細胞的比生長速率較高，但代謝副產物乙酸積累也隨之增加，同時高溫會使蛋白產生錯誤折疊、變性等，從而降低了酶活。

圖5 誘導溫度對菌體產酶的影響

2.6 優化前后菌體產酶的比較

分別采用優化后的誘導條件和初始條件同時進行發酵，圖6是對蛋白表達的SDS－PAGE檢測，在標準蛋白66200Da下方的條帶為目的蛋白的表達條帶(65100Da)。結果顯示，隨著乳糖誘導時間的延長，目的蛋白的表達量也有所提高，均高于IPTG作為誘導劑時的表達量。證明采用優化后的誘導條件進行發酵，不僅有效地提高了酶活，也提高了目的蛋白的表達。

圖6 優化前后目的蛋白的表達

2.7 酶學特性的研究

2.7.1 β－葡聚糖酶的最適反應溫度 將底物溶液分別在30、40、50、60、70、80、90℃水浴中保溫 10min，常規方法測定酶活。以溫度為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作圖，得到該酶的最適反應溫度。結果如圖7所示，隨著溫度的升高酶活逐漸上升，最適反應溫度為 70℃，溫度繼續升高，酶活會顯著下降，在80℃酶活僅有77.6%。

2.7.2 β－葡聚糖酶的熱穩定性 將待測酶液分別在40、50、60、70、80℃水浴中保溫，每隔 10min 取樣，立即冰浴，常規方法測定酶活。以溫度為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作圖，得到溫度對酶活的影響曲線。結果如圖8所示，β－葡聚糖酶在70℃以下，穩定性較好，保溫1h酶活最多損失不超過40%，70℃穩定性最高，保溫0.5h內損失不超過10%，在80℃僅20min酶活殘存已不足20%。

圖7 β－葡聚糖酶的最適反應溫度

圖8 β－葡聚糖酶的熱穩定性

2.7.3 β－葡聚糖酶的最適反應pH 配制pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5 的底物溶液，常規方法測定酶活。以pH為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作圖，得到pH對酶活的影響曲線。結果如圖9所示，β－葡聚糖酶在pH5.6～7.0之間，酶活相差不大，基本都維持在80%左右，較為穩定，最適反應pH為7.6，當pH＞7.6，隨著堿性升高，酶活不斷下降。

圖9 β－葡聚糖酶的最適反應pH

2.7.4 β－葡聚糖酶的pH穩定性 分別用pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0 的緩沖液配制酶溶液，室溫保溫1h，常規方法測定酶活。以pH為橫坐標，相對酶活力的百分比為縱坐標作圖，得到酶的pH穩定曲線。結果如圖10所示，β－葡聚糖酶在pH6～8之間，酶活都能維持在80%以上，穩定性范圍較寬，pH＜6時酶活顯著下降，pH為7時最穩定。

圖10 β－葡聚糖酶的pH穩定性

2.7.5 金屬離子對β－葡聚糖酶的影響 用不同金屬離子與酶液混合，常規方法測定酶活。以未添加任何鹽類的酶活為100%，結果顯示，Ca2+和Fe3+對β－葡聚糖酶的活性有一定的激活作用，Mg2+、Zn2+、Cu2+、K+、Na+和Fe2+對β－葡聚糖酶的活性具有抑制作用。

3 結論

IPTG是β－半乳糖苷酶底物的類似物，有很強的誘導力。在有IPTG誘導物存在的情況下，誘導物可與阻遏蛋白形成復合物使其構象發生改變，致使阻遏蛋白不能與O基因結合，從而促進基因表達。但IPTG價格昂貴，具有潛在的毒性，因此大多用于實驗室小規模表達。

乳糖是一種新近出現的誘導劑，鑒于其低廉無毒的特性，正在逐漸替代IPTG成為大規模發酵生產的誘導劑。它與IPTG誘導機理的最大差異在于［17］:IPTG可以直接進入大腸桿菌細胞內部且不會被細菌代謝，但乳糖只能在β－半乳糖苷透過酶的作用下進入細胞，且需要β－半乳糖苷酶轉化發揮作用。因此進行乳糖誘導基因工程菌生長和表達條件的研究是十分必要的。

本研究比較了IPTG和α－乳糖兩種誘導劑發酵重組大腸桿菌產β－葡聚糖酶的效果，結果顯示以乳糖作為誘導劑，不僅可以顯著提高酶活，也可以提高菌體目的蛋白的表達量，因此可以替代IPTG作為表達β－葡聚糖酶的誘導劑。在深入研究乳糖作為誘導劑時其濃度、誘導時機、誘導時間等因素對菌株生長和目的蛋白表達的影響后，發現當重組大腸桿菌培養6h(OD600達到0.7左右)后，加入終濃度為10mmol/L的α－乳糖，升溫至41℃，誘導6h，可達到的最大酶活為830.7U/mL，較初始以IPTG為誘導劑的情況，酶活提高2倍左右，且發酵周期縮短了70%，在誘導效果和效率方面都顯示了其極大的優勢。

以該重組菌種為來源菌種所產的β－葡聚糖酶pH穩定范圍較寬，熱穩定性良好，在生理溫度(70℃左右)下活性高，摒棄了以往工程菌的缺陷，具有廣闊的應用前景。

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Expression and characteristic of β－Glucanase in Escherichia coli induced by lactose

DAI Yi－xing，WANG Hong－xin，LV Wen－ping*，SUN Jun－tao，QIN Xiao－juan

(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The feasibility of expression of β－Glucanase in recombinant E.coli BL21 induced by lactose instead of IPTG was studied.The main factors of induction such as terminal concentration of lactose，the optimal time of induction，the duration and temperature of induction were analyzed.The results showed that the optimal condition was to add 10mmol/L(terminal concentration)lactose when the cell density achieved to OD6000.7，changed the temperature from 37℃ to 41℃ and induce 6h.The maximum enzyme activity of 830.7U/mL induced by lactose was higher 2 times than IPTG，and the period of fermentation shortened 70%.The enzyme was stable at pH6～8，and thermal stability，as well as high activity at the physiological temperature(about 70℃).The research demonstrated that lactose could be used as an efficient inducer of genetically engineered strain.

genetically engineered strain;β－Glucanase;lactose;IPTG;enzyme characteristic

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)09－0206－04

2010－12－06 *通訊聯系人

戴易興(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品功能因子開發。

無錫市科技創業計劃(CIE00920);國家自然科學基金(20090964)。