微小毛霉發酵制取凝乳酶的培養基優化研究

張麗紅，王 昕，樸姍善，鄭 麗，楊貞耐，*

(1.吉林大學生物與農業工程學院，吉林長春130024;2.中國農業科技東北創新中心農產品加工研究中心，吉林長春130033)

微小毛霉發酵制取凝乳酶的培養基優化研究

張麗紅1，2，王 昕1，樸姍善1，鄭 麗1，2，楊貞耐1，2，*

(1.吉林大學生物與農業工程學院，吉林長春130024;2.中國農業科技東北創新中心農產品加工研究中心，吉林長春130033)

利用響應面分析法優化微小毛霉的發酵培養基，提高微小毛霉凝乳酶的凝乳活力。在單因素實驗的基礎上，用Design－Expert軟件對實驗數據進行多元回歸分析，建立了3種因素與凝乳酶活力之間的函數關系，得出在基礎發酵培養基中加入的氯化鈣、乳清粉和葡萄糖的最佳濃度分別為0.58%、0.64%和1.13%，此時，微小毛霉凝乳酶的凝乳活力的理論值為1150.81SU/mL，驗證平均值為1109.7SU/mL，與預測值基本一致。

凝乳酶，微小毛霉，發酵培養基，優化

凝乳酶是天冬氨酸蛋白酶的一種［1］，通過剪切Phe105－Met106連接的к－酪蛋白使牛奶凝集，并為排除乳清提供條件［2－3］，同時對干酪的質構形成及干酪特有風味的形成有非常重要的作用。目前，干酪生產中應用的酶主要來源于動物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。動物凝乳酶以其凝乳活力與蛋白水解能力的高比值而成為制作奶酪的首選酶［4］，但隨著世界范圍內干酪產量的巨增，全球每年約需屠宰5000萬頭小牛，這導致世界范圍內凝乳酶供應缺乏［5］。微生物具有生長周期短、產量大、受氣候、地域、時間限制小且用其生產凝乳酶成本較低、酶提取方便、經濟效益高［6］等特點，因此，為緩和凝乳酶供不應求的現狀，在微生物中尋找合適的凝乳酶替代酶成為當前研究的熱點。常用產凝乳酶的微生物有微小毛霉、粟疫菌、米黑毛霉、易脆毛霉、少根根霉、卷枝毛霉、東京根霉、米曲霉和爪畦根霉等［7－10］，應用最多的是根霉及微小毛霉。根霉產凝乳酶的凝乳活力約為 72～92SU/mL［9－10］，活力較低，毛霉產凝乳酶的凝乳活力可達到 600～800SU/mL［11］，其中微小毛霉凝乳酶的蛋白水解活力比皺胃酶強，其蛋白水解能力相對較弱，對牛乳的凝固力也強，此外它還具有安全、無毒、活力高的特點［12－13］，因此，微小毛霉產生的凝乳酶被廣泛應用。本實驗利用響應面分析法對微小毛霉的發酵培養基進行了優化，提高了微小毛霉凝乳酶的凝乳活力，為篩選產凝乳酶的優良菌株提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

微小毛霉(Mucor pusillus)AS3.3345 購自中國普通微生物保藏管理中心。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA):馬鈴薯去皮，切成塊后稱取200g煮沸30min，然后用紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂 20g，溶化后補足水至 1000mL，121℃滅菌30min。

基礎發酵培養基:10g麩皮加10mL水裝于250mL三角瓶中，115℃滅菌20min。

1.3 種子培養和發酵

從保藏菌種中挑取少量菌絲接種于PDA斜面培養基上，30℃培養3d，斜面上即長滿孢子。向生長良好的斜面上加入10mL無菌水，洗下孢子，移入裝有玻璃珠和無菌水的三角瓶中振蕩，使菌體在玻璃珠的攪打下，充分打散，成為單孢子懸液，然后再用無菌脫脂棉進行過濾，調整孢子數為106個/mL，即為種子液。

吸取2mL種子液接種到發酵培養基中，30℃培養3d，然后加入40mL無菌水，搗碎培養物，室溫過夜，用無菌紗布過濾，濾液于8000r/min冷凍離心，棄沉淀，測定上清液的凝乳酶活力。

1.4 凝乳活性的測定

取10g脫脂奶粉，用0.01mol/L的CaC12溶液配制成10%的供試乳溶液。此溶液配制后在室溫放置40min后使用，當天使用有效。取5mL供試乳溶液，在35℃保溫10min，加入0.5mL適當稀釋的待檢樣品溶液(35℃保溫)，迅速混勻，并把試管傾斜45°以上，沿試管軸方向旋轉，觀察到管壁上開始出現凝集小顆粒為終點，準確記錄從酶加入到乳溶液凝固時間(凝乳時間一般控制在40～90s)。在上述條件下，40min凝結1mL脫脂乳的酶量定義為一個Soxhelt單位(SU)。

酶活力(SU)=(5/0.5)×D×2400/T

式中:D－酶液稀釋倍數;T－凝乳時間。

1.5 單因素實驗

本實驗先對培養基中的碳源、氮源、磷源、鈣源、酵母粉、鎂離子進行單因素實驗。實驗表明，CaCl2、乳清粉和葡萄糖對微小毛霉產凝乳酶的影響最大，在基本發酵培養基的基礎上添加葡萄糖時霉菌產酶的活性明顯比添加果糖的高;添加0.8%的乳清粉作為霉菌的碳源有利于菌株產高效的凝乳酶。隨著發酵培養基中CaCl2添加量的增加，其產生的凝乳酶活性也逐漸增加，當發酵培養基中CaCl2的添加量為0.5%時，其產生的凝乳酶活性最大，并且其蛋白水解活性也較低。

1.6 響應面法實驗

根據單因素實驗的結果，選取了CaCl2、乳清粉和葡萄糖這三個對微小毛霉產凝乳酶影響比較大的因素，采用響應面分析法對微小毛霉發酵培養基的組成進行優化。以凝乳酶活力為評價指標進行實驗，實驗因素與水平設計見表1。

2 結果與討論

2.1 回歸方程的建立與顯著性分析

對CaCl2濃度(Z1)、乳清粉濃度(Z2)和葡萄糖濃度(Z3)作如下變換:X1=(Z1－0.5)/0.2，X2=(Z2－0.6)/0.2，X3=(Z3－1)/0.5。以 X1，X2，X3為自變量，以凝乳酶活力為響應值(Y)，實驗方案及結果見表2。

表1 響應面分析因素與水平

表2 響應面分析方案及實驗結果

由表3可知，氯化鈣濃度、乳清粉濃度和葡萄糖濃度這三個因素中，氯化鈣濃度對凝乳酶活力影響最大，其次分別為葡萄糖濃度和乳清粉濃度。方程的相關系數為0.9516，說明響應值(凝乳酶活性)的變化有95.16%來源于所選變量，預測值與實測值之間具有高度相關性。校正相關系數為0.8896，說明該模型能夠解釋88.96%響應值的變化。回歸方程很好地擬合了實驗數據。由模型的P值為0.0008可以看出，模型應變量與全體自變量之間的線性關系是顯著的。失擬項P值為0.4468，沒有顯著影響，說明數據中沒有異常點。查F分布表，得F0.01(9，7)=6.72，失擬項F值為2.84小于F0.01(9，7)，方程的 F值為15.33大于F0.01(9，7)，從統計學意義上講該回歸方程具有高度顯著性，證明回歸方程真實、可靠，具有統計學意義。綜上可以認為，該方程的擬合度和可信度均較高，可用于代替實驗點對實驗結果進行分析。

2.2 響應因子水平的優化

為進一步直觀地說明氯化鈣濃度、乳清粉濃度和葡萄糖濃度之間的交互作用和對凝乳酶活性的影響，利用Design Expert軟件根據回歸分析結果做出相應的曲面圖(圖1～圖3)。由3組響應面圖的平滑程度可以直觀地看出，氯化鈣的濃度對微小毛霉凝乳酶的活性影響最顯著，表現為曲線較陡，葡萄糖次之，乳清粉對微小毛霉凝乳酶的活性影響最不顯著，表現為曲線較平滑。且由響應面立體圖可以看出，X1，X2和X3存在極值點，且最優工藝條件為X1=0.58，X2=0.64，X3=1.13，即微小毛霉產凝乳酶的最佳發酵培養基條件為:氯化鈣濃度0.58%、乳清粉濃度0.64%、葡萄糖濃度1.13%，微小毛霉產凝乳酶的活性的理論值為1150.81SU/mL。

表3 回歸方差分析表

2.3 模擬驗證實驗

為進一步確定計算結果，按最佳條件進行3次重復實驗，最終的凝乳酶活力分別為 1142.76、1142.86、1043.48SU/mL，平均值為 1109.7SU/mL，與預測值(1150.81SU/mL)基本一致，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法適用于對微小毛霉產凝乳酶的發酵培養基進行回歸分析和參數優化。并且優化后所測得的凝乳酶活力要比單因素實驗所測得的凝乳酶活力值高，說明可以用此方法對微小毛霉的發酵培養基進行優化。

圖1 Y=f(X1，X2)的響應面圖

圖2 Y=f(X2，X3)的響應面圖

3 結論

圖3 Y=f(X1，X3)的響應面圖

本實驗通過對微小毛霉的發酵培養基進行了優化，提高了微小毛霉凝乳酶的凝乳活力。利用模型的響應面對影響凝乳酶活性的關鍵因子及其相互作用進行探討，優化出微小毛霉產酶發酵培養基中CaCl2、乳清粉和葡萄糖的最佳濃度分別為0.58%、0.64%和1.13%，在該最佳培養條件下，微小毛霉產凝乳酶的活性的理論值為1150.81SU/mL，驗證平均值為1109.7SU/mL，與預測值基本一致，證明此模型是合理可靠的，可用于實際預測，為科研工作者進一步篩選產凝乳酶的優良菌株提供依據。

［1］Supannee Chitpinityol，M James C.Crabb Chymosin and proteinases［J］.Food Chemisry，1998，6199(4):395－418.

［2］鐘繼才.凝乳酶在干酪生產中的應用［J］.中國乳品工業，2006，36(1):54－56.

［3］姜峰，張蘭威.我國凝乳酶特性及其替品的研究現狀［J］.食品研究與開發，2003，24(6):3－6.

［4］周俊清，林親錄，趙謀明.微生物源凝乳酶的究進展［J］.中國食品添加劑，2004(2):6－9.

［5］Grag A K，Johri B N.Rennet:current trends and futurere seareh［J］.Food Reviews International，1994，10(3):313－355.

［6］錢世鈞，張純青，矯慶華，等.微小毛霉凝乳酶的純化和性質［J］.微生物學報，1989，29(4):272－277.

［7］張紅梅.凝乳酶的研究進展綜述［J］.同濟大學學報:醫學版，2004，25(3).

［8］曾劍超.國內凝乳酶的研究應用及其替代品的研究發展［J］.開發與研究，2008，25(1):13－16.

［9］韓玲玲，潘道東.根霉產凝乳酶的固態發酵條件的研究［J］.食品科學，2010，31(9):156－160.

［10］葉為標.根霉產凝乳酶發酵條件的研究［J］.食品研究與開發，2007，128(8):53－57.

［11］張娜，郭慶啟，趙新淮.表面毛霉成熟干酪制備工藝優化

［J］.食品工業科技，2010，31(1):210－212，216.

［12］李玉秋，王景會，李鐵柱，等.重組微小毛霉凝乳酶的發酵條件及其酶學性質［J］.食品科學，2010，31(19):225－230.

［13］Hideyuki K，Kazuo.Rapid and large scale lsolation of chymosin by pepstatin－aminohexy lagarose［J］.Agric Bid Chem，1978，42(2):2227－2231.

Optimization of fermentation medium to producing chymosin by Mucor pusillus

ZHANG Li－hong1，2，WANG Xin1，PIAO Shan－shan1，ZHENG Li1，2，YANG Zhen－nai1，2，*

(1.School of Biological and Agricultural Engineering Jilin University，Changchun 130024，China;2.Northeast Agricultural Research Center of China，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China)

Optimization of the medium for fermentation by Mucor pusillus to produce chymosin was carried out by response surface analysis to increase the activity of milk－clotting enzyme(MCE).Based on the single factor test，the polynomial regression analysis was performed on the experimental data by using Design－Expert software and the functional relationship between the three primary components and the MCE activity were built.The optimal values of the factors were obtained:CaCl2was 0.58%，whey powder was 0.64%，glucose was 1.13%.Under the optimized conditions，the theory value of Mucor pusillus MCE activity was 1150.81SU/mL，and the average value tested was 1109.7SU/mL which was similar to the theory value.

chymosin;Mucor pusillus;fermentation medium;optimization

TS201.3

A

1002－0306(2011)09－0214－04

2011－04－22 *通訊聯系人

張麗紅(1985－)，女，碩士，研究方向:食品科學。

863現代農業探索導向項目(2006AA10Z306);農業部現代奶牛產業技術體系乳制品加工專項、科學前沿與交叉學科創新項目(200903276)。