藍莓葉中抗氧化物質提取工藝研究

徐麗珊，黃啟亮，汪雪君

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004)

藍莓葉中抗氧化物質提取工藝研究

徐麗珊，黃啟亮，汪雪君

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004)

主要以對DPPH自由基的清除能力為抗氧化指標，研究藍莓葉中抗氧化物質的提取工藝。探究了pH、提取溫度、料液比、提取時間等因素對藍莓葉中抗氧化物質提取的影響。在單因素和正交實驗中，確定了各因素影響藍莓葉中抗氧化物質提取的主次順序為:料液比＞提取溫度＞酸堿度＞提取時間，并得到了最佳提取工藝條件:料液比為1∶14(g∶mL)，提取溫度為100℃，酸堿度為pH2.0，提取時間為60min。最佳工藝條件下，藍莓葉提取物中抗氧化活性為159.88mg/g·FW。

藍莓葉，抗氧化活性，DPPH，提取工藝，正交實驗

近些年，從植物中尋找安全、高效的天然抗氧化劑成為食品研究的熱點。藍莓是杜鵑花科越橘屬植物，原產、主產于美國，其果實中含有豐富的抗氧化物質［1］，是一種被聯合國糧農組織(FAO)公認的營養保健果品。我國藍莓栽培雖然起步晚，但發展勢頭迅猛，浙江省栽培面積就已近萬畝，而且還在不斷迅速擴張，隨之而來，就會產生大量的藍莓葉。相關研究表明，藍莓葉中也含有豐富的抗氧化物質［2］，如黃酮類物質等［3］，具有很高的藥用價值［3－5］。如從藍莓葉中提取抗氧化物質，就可更好地實現藍莓葉的存在價值。本實驗旨在探討提取藍莓葉中的抗氧化物質的提取工藝，以尋求新型、高效的天然抗氧化劑的制備方法，提高藍莓種植的經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮、嫩綠、豐碩的藍莓葉 取自浙江師范大學藍莓基地;無水乙醇 分析純，杭州蕭山化學試劑廠;DPPH 上海如吉生物科技有限公司。

Uv1000紫外吸光光度計 上海天美科學儀器有限公司;分析天平、PB－10 pH計 北京賽利多新斯儀器系統有限公司;Sc－5A超級恒溫箱 寧波海曙億恒儀器有限公司;GZX－9140MBE數顯不銹鋼鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;日立CR22G高速冷凍離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓葉提取液的制備 稱取一定量洗凈瀝干并剪碎的藍莓葉，按一定的料液比加入提取劑，恒溫浸提一定時間，離心，將提取液定容到一定體積。

1.2.2 DPPH標準曲線的繪制 精確稱取DPPH 10.0mg，用無水乙醇定容至 100mL，配成濃度為0.1mg/mL 的溶液。吸取 0.00、1.00、1.00、0.50、0.50、0.50、0.25mL 溶液，分別加入無水乙醇 2.00、4.00、3.00、4.50、7.00、6.00mL，從而得到濃度為 0.00、4.00、6.70、10.00、14.30、20.00、33.30μg/mL 的 DPPH 標準液。以無水乙醇做空白對照，在517nm處測標準液的OD值。以標準液濃度和OD值回歸處理后，制作標準曲線。

1.2.3 DPPH法測定抗氧化物質的含量

1.2.3.1 自由基的清除率計算 取稀釋的提取液2mL，加入2mL配制的DPPH溶液，混勻靜置60min，517nm處測其吸光度(Ai)，以溶劑為參比，于517nm處測定吸光度(Ac);同時，取稀釋的提取液2mL，加入2mL無水乙醇，充分混勻，測定空白對照的517nm處的吸光度(Aj)。

式中:Ac:2mL溶劑加2mL DPPH溶液的吸光度(僅含DPPH乙醇溶液);Ai:加2mL待測液加2mL DPPH溶液的吸光度;Aj:2mL待測液加2mL溶劑的吸光度空白對照的吸光度值(樣品與無水乙醇用以消除樣品本身顏色的影響)。

1.2.3.2 抗氧化物質活性計算:

抗氧化活性(清除DPPH量，mg/g·FW)=清除率×(DPPH濃度×體積)/(樣品濃度×樣品體積)［7］

1.2.4 單因素實驗 本實驗對藍莓葉中抗氧化物質提取進行工藝優化，主要選用提取溫度、提取時間、料液比和酸堿度作為考察因素。

1.2.5 正交設計實驗 通過單因素實驗結果分析，選擇提取溫度、提取時間、料液比和酸堿度4個因素，設計了4因素3水平正交實驗，所采用的正交表為L9(34)，以浸提液中抗氧化物質活性作為實驗結果，篩選藍莓葉中抗氧化物質提取的最佳條件。

1.3 統計學處理

采用Excel 2003進行回歸和相關分析。

2 結果與討論

2.1 DPPH標準曲線及方程

回歸方程為 y=23.209x+0.0078，R2=0.9996，其中y為實驗所得的吸光值，x為樣品濃度(mg/mL)，標準曲線見圖 1。結果表明，DPPH濃度在0～0.0333mg/mL范圍內具有良好的線性關系。

圖1 DPPH標準曲線

2.2 提取溶劑的確定

常用的溶劑有水、甲醇、乙醇、丙酮等。甲醇毒性較大，丙酮的毒性也比較高，丙酮沸點較低，極易揮發，生產過程中損失較大，提取后若去除不完全，會存在安全性問題，不宜用于實際生產;而乙醇廣泛應用于活性成分的提取，安全性高。故以乙醇、水為溶劑設計實驗。

稱取一定量洗凈瀝干剪碎的藍莓葉，按照料液比為 1∶10，分別加入 0%、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液置于40℃的水浴鍋中，浸提60min。測定藍莓葉提取液的抗氧化活性，結果如圖2。

圖2 不同濃度乙醇對提取物抗氧化活性的影響

由圖2可知，在乙醇濃度為0%～30%之間，隨乙醇濃度增大，抗氧化活性增大;當乙醇濃度再增大時，抗氧化活性反而降低。

分別以30%乙醇溶液和自來水為提取溶劑，其余提取條件相同，比較提取物的抗氧化活性，結果如表1。

表1 不同提取溶劑對提取物抗氧化活性的影響

表1表明，自來水(100℃)的抗氧化活性比30%(40℃)的乙醇溶劑高，而且在實際生產中，水比乙醇溶液經濟實惠很多，操作也方便，所以采用水作為提取溶劑，作為工藝優化的提取方法。

2.3 水提法提取藍莓葉中抗氧化物質

2.3.1 單因素實驗

2.3.1.1 提取溫度的影響 稱取一定量剪碎的藍莓葉，按照料液比 1∶10 加入自來水，分別在 40、60、80、100℃下提取60min，結果如圖3。

圖3 溫度對提取物抗氧化活性的影響

由圖3可看出，隨著提取溫度的升高，抗氧化物質活性呈上升趨勢，可見提取溫度對抗氧化物質提取有一定的影響。

2.3.1.2 料液比的影響 稱取一定量剪碎的藍莓葉，按照料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 自來水，在80℃下提取60min，結果如圖4。

由圖4可看出，隨料液比的增大，抗氧化活性逐漸增大，表明隨料液比的增加，藍莓葉中抗氧化物質的提取率逐漸增加，當料液比1∶14時，對抗氧化物質提取效果最好，提取液抗氧化活性最高。

圖4 料液比對提取物抗氧化活性的影響

2.3.1.3 pH的影響 稱取一定量剪碎的藍莓葉，按料液比1∶10分別加入 pH 為 2、4、6、8 的自來水，在80℃下提取60min，結果如圖5。

圖5 不同pH對提取物抗氧化活性的影響

由圖5可見，當提取液pH=2時，抗氧化活性最高，pH在4～8時藍莓葉提取液抗氧化活性趨于平衡，且差異并不顯著，可知在此pH區間對藍莓葉抗氧化物質提取影響不大。

2.3.1.4 提取時間的影響 稱取一定量剪碎的藍莓葉，按照料液比1∶10加入自來水，在80℃下分別提取 30、60、90、120、150、180min，結果如圖 6。

圖6 不同提取時間對提取物抗氧化活性的影響

結果如圖6，提取時間為30～60min時，抗氧化活性逐漸提高，提取時間60～180min時，抗氧化活性逐漸降低。在不同的提取時間條件下，抗氧化活性變化趨勢并不明顯，可見提取時間對藍莓葉抗氧化物質的提取影響不明顯。由圖可知，提取時間為60min時抗氧化活性最高，與其他提取時間相比較，差異極顯著(P＜0.01)。

2.3.2 正交實驗 在單因素實驗的基礎上，選提取溫度、料液比、pH、提取時間為考察因素，以藍莓葉提取液中抗氧化活性為指標，采用正交表L9(34)進行優化正交實驗。利用4因素3水平正交實驗分析了上述因素對藍莓葉中抗氧化物質提取效果的影響，分析藍莓葉中抗氧化物質的最佳提取工藝。因素水平選取如表2所示，正交實驗結果及分析見表3。

由表3可知，對藍莓葉提取液抗氧化活性影響最顯著的是料液比，其次是提取溫度、pH、提取時間。在實驗設計范圍內，最優組合為A3B3C2D1，即料液比為1∶14，提取溫度 100℃，pH2，提取時間為 60min。實驗9的提取工藝條件滿足最佳工藝條件，可取得最高的抗氧化活性159.88mg/g·FW。

表2 正交實驗因素水平表

表3 藍莓葉抗氧化活性正交實驗結果

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗，可知影響藍莓葉抗氧化物質提取率的因素順序為:料液比＞提取溫度＞pH＞提取時間;確定了藍莓葉抗氧化物質的最佳提取工藝條件為:提取溫度 100℃，提取時間60min，pH2，料液比為 1∶14(g∶mL)。在此工藝條件下，藍莓葉提取物抗氧化活性最高。

本實驗通過比較不同提取條件對藍莓葉抗氧化物質提取的影響，尋找出一種最佳的提取條件，應用于抗氧化產品的研究開發，以新型天然產品取代化學合成品。這不僅合理利用了藍莓葉，使之“變廢為寶”，而且為抗氧化產品的生產提供了新的抗氧化資源，為今后更加進一步開發利用藍莓葉積累了寶貴的經驗，進行了有益的探索。

［1］王玲，李正全，潘太全.藍莓富含抗氧化物質［J］.中國果業信息，2009(4):28.

［2］張穎暢，孟憲軍，李小紅.大孔樹脂純化藍莓葉總黃酮的工藝研究［J］.食品與發酵工業，2008，34(1):133－137.

［3］曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進展［J］.西北植物學報，2003，23(12):241－247.

［4］Chung H S，Chang L C，Lee S K，et al.Flavonoid constituents of chorizanthe diffusa with potential cancer chemopreventive activity［J］.Agric Food chem，1999，47(1):36－41.

［5］戰偉偉，司振軍，王超萍，等.藍莓葉原花青素提取工藝研究［J］.糧食與油脂，2010(6):39－42.

［6］彭長蓮，陳少薇，林植芳，等.用清除有機自由基DPPH法評價植物抗氧化能力［J］.生物化學與生物物理進展，2000，27(6):658－661.

［7］陳守江，姜松.果蔬貯藏過程中內源總抗氧化活性的變化［J］.食品科學，2004，25(6):172－175.

Study on the extraction technology of antioxidant activity from blueberry leaves

XU Li－shan，HUANG Qi－liang，WANG Xue－jun

(Zhejiang Normal University College of Chemistry and Life Science，Jinhua 321004，China)

Extraction technology for antioxidant activity from blueberry leaf was optimized，and the clearance of DPPH free radical as an indicator was taken for antioxidant.Different pH，extraction temperature，the ratio of solid to liquid and extraction time were compared on the effect of the antioxygenic activity of extractions.With single factor and orthogonal experiments，the primary and secondary order of effect of the factors water extraction method for the extractions antioxidant activity from blueberry leaves was determined:the ratio of solid to liquid＞extraction temperature＞pH＞extraction time.The optimum process conditions was determined:the ratio of solid to liquid was 1∶14(g∶mL)，temperature was 100℃，pH was 2.0，extraction time was 60min.Under the above conditions，the antioxygenic activity could reach to be 159.88mg/g·FW.

blueberryleaf;antioxygenicactivity;DPPH spectrophotometricmethod;extractionprocess;orthogonal experiment

TS255.1

B

1002－0306(2011)09－0270－03

2010－10－08

徐麗珊(1966－)，女，副教授，碩士，研究方向:生理生化和食品營養。

浙江省科技計劃項目(2010C34002)。