啤酒中嘌呤的純化及反相離子對(duì)色譜法測(cè)定的研究

何 炘，陳靜波，劉繪景，劉 華

(浙江省飲用水質(zhì)量檢驗(yàn)中心，浙江杭州311700)

啤酒中嘌呤的純化及反相離子對(duì)色譜法測(cè)定的研究

何 炘，陳靜波，劉繪景，劉 華

(浙江省飲用水質(zhì)量檢驗(yàn)中心，浙江杭州311700)

利用反相離子對(duì)色譜法研究了啤酒中的鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的測(cè)定方法。結(jié)果表明，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流動(dòng)相為0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液中加入1mmol/L的己烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH至3.6，用四元泵調(diào)節(jié)甲醇含量為3%(v/v)，流速為1.0mL/min時(shí)，分離良好，方法精密度為1.21%～2.04%，測(cè)得四種嘌呤物質(zhì)的回收率在95.97%～101.74%之間。對(duì)存在離子和非離子化合物的嘌呤而言，該方法較普通反相色譜法更具可行性。利用沉淀法純化啤酒中的嘌呤后，所得色譜圖幾乎無干擾峰，使定量和定性工作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。

啤酒，嘌呤，反相離子對(duì)色譜，純化

啤酒營(yíng)養(yǎng)豐富，口感獨(dú)特，為人們所喜歡。但啤酒中含有較高的嘌呤類物質(zhì)，攝入太多容易引起嘌呤的代謝紊亂，從而引發(fā)痛風(fēng)、血毒癥等疾病。隨著人們健康意識(shí)的提高，啤酒中的嘌呤含量也逐漸受到重視。啤酒中嘌呤類物質(zhì)水解產(chǎn)物主要有鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤。目前啤酒中四種嘌呤含量的檢測(cè)大都采用反相高效液相色譜法［1－2］，而利用反相離子對(duì)色譜(RP－IPC)法檢測(cè)啤酒中嘌呤含量的研究至今都鮮見報(bào)道。嘌呤類物質(zhì)是兩性弱電解質(zhì)，其離解基團(tuán)較多，這些基團(tuán)在適當(dāng)?shù)膒H下離解為陰離子或陽離子。在酸性溶液中，鳥嘌呤、腺嘌呤的氨基基團(tuán)為弱陽離子，能與烷基磺酸類陰離子形成離子對(duì)［3］。本研究擬采用己烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑分析酸性條件下嘌呤分離的色譜條件。在樣品分析中，前處理是一個(gè)重要的組成部分。理想的樣品處理方法應(yīng)該簡(jiǎn)單、快速、回收率高，并能消除干擾。目前國內(nèi)對(duì)于啤酒嘌呤檢測(cè)的樣品前處理都停留在嘌呤的提取步驟上，即酸水解，樣品純化步驟的研究未見報(bào)道。但是實(shí)際上，啤酒本身是一種發(fā)酵產(chǎn)物，成分復(fù)雜，酸水解后的一些小分子物質(zhì)(如無機(jī)離子、糖、磷酸糖類、氨基酸、嘧啶)對(duì)嘌呤的分離有不同程度的干擾，直接進(jìn)樣對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響很大。從結(jié)構(gòu)上看，嘌呤是含氮豐富的有機(jī)化合物，嘌呤環(huán)上的氮原子帶有孤電子對(duì)，銀離子有空的s軌道，可以接受氮原子上的孤對(duì)電子形成嘌呤銀配離子。假設(shè)嘌呤用 P表示，該配離子可表示為［Ag(P)x］+，若溶液中有 OH－存在的話，它勢(shì)必與OH－結(jié)合形成［Ag(P)x］OH，該化合物在堿性條件下易形成白色絮狀沉淀，而在酸性條件下沉淀又會(huì)重新解離到溶液中［4］。本研究擬利用嘌呤的特異性沉淀反應(yīng)，參照 N.E.Obispo［5］的方法，加以改進(jìn)，從而純化啤酒樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳥嘌呤(Gua)、腺嘌呤(Ade)、黃嘌呤(Xan)、次黃嘌呤(Hyp)標(biāo)準(zhǔn)樣品 Sigma公司;甲醇 色譜純;磷酸、磷酸二氫鉀、己烷磺酸鈉 優(yōu)級(jí)純;高氯酸、鹽酸、硝酸銀、磷酸二氫銨、氫氧化鈉 分析純;啤酒 當(dāng)?shù)厥惺?沉淀劑 100mL沉淀劑含0.6mL高氯酸，4.4mL 0.0285mol/L磷酸二氫銨，5mL 0.4mol/L硝酸銀和90mL 0.2mol/L磷酸二氫銨。

LC1200高效液相色譜 包括Agilent1200系列在線真空脫氣機(jī)、四元泵、紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器和 LC系統(tǒng)化學(xué)工作站，Agilent公司;TDL－5－A離心機(jī) 上海安科儀器廠;HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇江南儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嘌呤標(biāo)樣的制備 準(zhǔn)確稱取鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤100mg，用超純水溶解后定容于100mL容量瓶中，制成1g/L的儲(chǔ)備液(嘌呤不易溶于水可加入氫氧化鈉或鹽酸助溶)，置于2～4℃冰箱中冷藏保存。

1.2.2 啤酒樣品的提取 取200mL啤酒滴加1滴消泡劑進(jìn)行消泡。取2mL消泡后的啤酒樣品，加2mL 70%高氯酸，95℃恒溫水浴水解1h。

1.2.3 啤酒樣品的純化 將啤酒水解液轉(zhuǎn)移到25mL離心管中，加入1mL 0.4mol/L硝酸銀和18mL 0.2mol/L磷酸二氫銨，振蕩混勻，滴加40%(w/v)的氫氧化鈉直至沉淀出現(xiàn)。將離心管置于離心機(jī)中，3000r/min下離心25min，小心吸掉上清液，離心管中沉淀加入10mL沉淀劑，混勻后3000r/min再次離心25min，小心吸掉上清液，離心管中沉淀加入8mL 0.5mol/L鹽酸，充分混合，95℃恒溫水浴 30min，3000r/min下離心25min，上清液定容至10mL容量瓶中，用0.45μm膜過濾，濾液進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Waters Atlantis C18(4.6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相:0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，加入1mmol/L己烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.6，用四元泵調(diào)節(jié)甲醇含量為3%(v/v)，使用前用0.45μm膜過濾，并用超聲波脫氣15min;流量1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣體積20μL，柱溫25℃。

1.2.5 分析方法 用反相離子對(duì)色譜法檢測(cè)啤酒中的嘌呤類物質(zhì)，采用保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量。啤酒中總嘌呤類物質(zhì)含量=CGua+CAde+CXan+CHyp。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 pH的影響 嘌呤類物質(zhì)是兩性弱電解質(zhì)，在酸性溶液中，鳥嘌呤、腺嘌呤的氨基基團(tuán)為陽離子，其pKa值分別為3.2和4.1。本研究中流動(dòng)相采用0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液中加入5mmol/L己烷磺酸鈉，以磷酸調(diào)節(jié)pH至3.4～6.4，所檢出的三種嘌呤的保留時(shí)間見圖1，腺嘌呤由于保留時(shí)間過長(zhǎng)(大于60min)未做研究。如圖1所示，在pH3.4～6.4間，黃嘌呤和次黃嘌呤的保留時(shí)間變化不大，鳥嘌呤的保留時(shí)間在pH小于4.2時(shí)快速增加，pH越低，保留時(shí)間越長(zhǎng)。該結(jié)果表明，在pH4.2時(shí)鳥嘌呤部分氨基基團(tuán)已轉(zhuǎn)為陽離子，與己烷磺酸離子形成離子對(duì)而增大了保留時(shí)間，pH越低，越多的鳥嘌呤氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為陽離子，從而保留時(shí)間越長(zhǎng)。可以推測(cè)腺嘌呤具有相同的趨勢(shì)。因此流動(dòng)相的pH小于4.2比較合適。

圖1 流動(dòng)相pH對(duì)保留時(shí)間的影響

2.1.2 有機(jī)溶劑的影響 由于pH小于4.2時(shí)，鳥嘌呤和腺嘌呤與己烷磺酸離子在流動(dòng)相中形成離子對(duì)，其疏水性強(qiáng)，保留時(shí)間過長(zhǎng)(見圖1)，有必要加入有機(jī)溶劑縮短保留時(shí)間。本研究中流動(dòng)相采用

0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液中加入1mmol/L己烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH至3.8，用四元泵調(diào)節(jié)甲醇含量，所檢出的四種嘌呤的保留時(shí)間見圖2。如圖2所示，隨著甲醇含量的增加，四種嘌呤的保留時(shí)間都縮短了，其中腺嘌呤最為明顯。流動(dòng)相中甲醇的含量太高，四種嘌呤的分離會(huì)變差，甲醇加入量在3%(v/v)比較合適。

圖2 甲醇濃度對(duì)保留時(shí)間的影響

2.1.3 己烷磺酸鈉濃度對(duì)保留時(shí)間的影響 在烷基磺酸類離子對(duì)試劑中，己烷磺酸鈉的疏水性居中。本研究中流動(dòng)相采用0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液中加入不同濃度的己烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH至3.8，用四元泵調(diào)節(jié)甲醇含量為3%(v/v)。如圖3所示，隨著己烷磺酸鈉濃度的增加，鳥嘌呤和腺嘌呤的保留時(shí)間增加，其中腺嘌呤最為明顯，次黃嘌呤和黃嘌呤的保留時(shí)間變化不大。而且，己烷磺酸鈉濃度太高，會(huì)造成分析時(shí)間過長(zhǎng)，而濃度太低，也會(huì)造成鳥嘌呤的分離變差。因此采用1mmol/L的己烷磺酸鈉比較合適。

圖3 己烷磺酸鈉濃度對(duì)保留時(shí)間的影響

以下實(shí)驗(yàn)采用的流動(dòng)相均為0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液中加入1mmol/L的己烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH到3.6，用四元泵調(diào)節(jié)甲醇含量為3%(v/v)，四種嘌呤標(biāo)樣的液相色譜圖見圖4。

圖4 四種嘌呤混合物標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

2.2 嘌吟標(biāo)樣的線性關(guān)系、線性范圍和檢出限

將四種嘌呤標(biāo)樣儲(chǔ)備液進(jìn)行梯度稀釋，配制成50、25、10、5、1、0.5、0.1mg/L 不同質(zhì)量濃度的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，以峰面積與樣品濃度作線性回歸，結(jié)果見表1。按信噪比3∶1計(jì)算檢出限，由表1可以看出，在0.1～50mg/L范圍內(nèi)，濃度和峰面積呈很好的線性關(guān)系。

表1 RP－IPC法測(cè)定嘌呤的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和精密度(n=10)

2.3 精密度測(cè)定

取同一濃度的四種嘌呤混合標(biāo)樣，同一天連續(xù)進(jìn)樣10次測(cè)定精密度，結(jié)果用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來表示，見表1。由表1可以看出，采用RP－IPC法測(cè)定該四種嘌呤重復(fù)性好，精密度高(RSD＜3%)。

2.4 啤酒樣品中嘌呤的純化

N.E.Obispo純化方法中磷酸二氫銨試劑的加入一方面是用于中和多余的銀離子，形成黃色沉淀Ag3PO4;另一方面，沉淀量的增加有助于離心過程中［Ag(P)x］OH的全部沉淀。鹽酸的選擇主要是由于酸的加入使［Ag(P)x］OH中的銀變?yōu)殂y離子，鹽酸中的氯離子可與其反應(yīng)生成白色沉淀將其從溶液中去除。但因其方法取樣量小(0.1～0.5g)，稀釋倍數(shù)高(約100倍)，方法限高，不利檢測(cè)。本研究改進(jìn)了該方法，加大了取樣量(2mL)，減少了稀釋，并調(diào)整了相關(guān)的試劑量和步驟。啤酒樣品純化前后液相色譜圖見圖5、圖6。比較圖5和圖6可以看出，啤酒樣品純化前每個(gè)嘌呤峰都有干擾峰，次黃嘌呤與一個(gè)大的干擾峰重疊，很容易造成誤判，其他嘌呤峰定量也都非常困難。啤酒樣品純化后，除四種嘌呤峰外幾乎無干擾峰，使定量和定性簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。

圖5 啤酒樣品純化前色譜圖

圖6 啤酒樣品純化后色譜圖

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在已知含量的樣品中加入不同質(zhì)量濃度的四種嘌呤標(biāo)樣溶液，混合均勻，按上述方法和條件各測(cè)定10次，求回收率的平均值。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果(n=10)

3 結(jié)論

在酸性條件下，利用反相離子對(duì)色譜法測(cè)定啤酒中的鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤。在該分離方法中，己烷磺酸鈉是合適的離子對(duì)試劑，它可使嘌呤分離良好，方法精密度高。而利用嘌呤的特異性沉淀純化啤酒中的嘌呤，消除了絕大多數(shù)啤酒基質(zhì)成分的干擾，回收率高。

［1］李志良，張五九.高效液相色譜法測(cè)定麥汁、發(fā)酵液和啤酒中的嘌呤含量［J］.分析與檢測(cè)，2006，32(3):73－75.

［2］鐘曉盈，陸幼蘭.利用 HPLC測(cè)定啤酒嘌呤含量方法的研究［J］.啤酒科技，2007(3):23－25.

［3］朱彭齡，云自厚，謝光華.現(xiàn)代液相色譜［M］.蘭州:蘭州大學(xué)出版社，1989:150－160.

［4］侯志敏，劉玉杰，劉洪波.關(guān)于嘌呤堿鑒定實(shí)驗(yàn)異常現(xiàn)象的探討［J］.河北理科教學(xué)研究，2005(2):54－55.

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Study on purification of purines in beer and determination of purines compounds by reversed－phase ion pair chromatography

HE Xin，CHEN Jing－bo，LIU Hui－jing，LIU Hua

(Zhejiang Quality Testing Center for Drinking Water，Hangzhou 311700，China)

Four purines(Gua，Ade，Xan and Hyp)were separated and determined by reversed－phase ion pair chromatography.The optimized chromatography conditions were as following:254nm by UV detector with 0.02mol/L of KH2PO4buffer solution added 1mmol/L 1－Hexanesulfonic acid sodium(pH=3.6 regulated by H3PO4and methanol concentration=3%(v/v)regulated by quaternary pump)as mobile phase，and flow rate at 1.0mL/min.The average recoveries of four purines were 95.97%～101.74%，with the accuracy of the method as RSD of all four purines were 1.21%～2.04%.This method provided more feasibility than normal reversed－phase chromatography as to the purines including ion and non－ionic compound.The chromatography of beer sample was without interfering peak almost after beer sample purified by precipitation method，because of that determine the chemical composition and amount became simple and accurate.

beer;purine;reversed－phase ion pair chromatography;purification

TS207.3

A

1002－0306(2011)09－0420－03

2010－09－10

何炘(1980－)，男，碩士研究生，主要從事食品化學(xué)分析工作。

浙江省質(zhì)監(jiān)系統(tǒng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(20090310)。