一種檢測肉品的新型通用單引物多重PCR技術

商 穎，許文濤，，* ，元延芳，梁志宏，石 慧，翟志芳，張雅楠，羅云波，，黃昆侖，，*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083;2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心(北京)，北京100083)

一種檢測肉品的新型通用單引物多重PCR技術

商 穎1，許文濤1，2，*，元延芳2，梁志宏2，石 慧1，翟志芳1，張雅楠2，羅云波1，2，黃昆侖1，2，*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083;2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心(北京)，北京100083)

在市場中，牛、羊肉中摻雜價格便宜的豬肉，以次充好的欺騙行為屢見不鮮，而且近些年來出現瘋牛病、禽流感等疾病，肉品的種屬鑒定變得至關重要。隨著分子生物學的深入研究，多重PCR技術得到了飛快的發展，但是其擴增效率和檢測限達不到理想要求。為尋找快速、靈敏、特異的檢測生肉品種的方法，在普通多重PCR的基礎上發展了一種新的通用單引物多重PCR(CSP－M－PCR)技術，該方法的體系中，所有目的片段共用一樣的上游引物進行擴增，檢測限可達5μmol/L。此方法不僅彌補了普通多重PCR擴增效率較低、檢測限不理想的缺點，還提高了檢測的靈敏度、降低了檢測的成本。

多重PCR，通用單引物，同時檢測，肉品種屬

隨著我國經濟的快速發展，人民消費水平的逐漸提高，消費者對食品質量與安全性的要求也越來越高，在國內及國際貿易中，牛、羊肉中摻雜價格便宜的豬肉，以次充好的欺騙行為屢見不鮮，嚴重損害了消費者的利益［1］，而且當肉品加工成肉餡，單憑其外觀更難鑒別是哪個品種［2］。近些年瘋牛病、禽流感等疾病的出現，生肉制品的摻假摻雜現象不僅涉及到消費者的宗教(如在清真食品中摻入豬肉、豬油)、經濟等問題，也涉及到消費者的健康和市場監管問題［3］，因此急需一種快速、準確的檢測方法以對肉制品成分進行種屬鑒定。20世紀80年代，國外開始對肉的種屬鑒定進行研究，采用的方法主要有DNA雜交、免疫擴散和等電點聚焦［4］等，這些方法大都存在著成本高、工作量大、對檢測對象要求高等缺點［5］。隨著現代免疫學和分子生物學理論和技術的不斷發展，聚合酶鏈式反應(PCR)技術因其特異性強、靈敏度高、操作簡單等優點，也被應用到肉制品品種的檢測中［6］。由于單一PCR檢測成本高，肉品中可能存在其它品種，單重PCR已經滿足不了現有的要求，進而出現了多重PCR技術，其是在常規PCR基礎上改進并發展起來的一種新型PCR擴增技術，是在同一反應體系中加入多對引物同時擴增多條目的DNA片段的方法［7］。但是，多重PCR中也存在一些不足，如體系中存在多對引物而導致的擴增效率較低、不同模板之間的擴增效率不一致等［8］，這些都限制了此項技術的商業化應用。因此，建立一種能快速、靈敏、特異的檢測生肉品種的檢測方法一直是有待解決的難題。本研究在普通多重PCR的基礎上建立了一種通用單引物多重PCR技術(common single primer multiplex polymerase chain reaction，CSP－MPCR)，此技術不僅可以避免普通多重PCR擴增效率低的缺點，而且可以降低反應體系的檢測限和成本，提高反應靈敏度，從而為簡便、快速、準確的檢測肉品種屬提供一種新方法。

表1 引物序列

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞肉、牛肉、羊肉和豬肉 本研究采用的4種生肉材料，均購自本地市場，將4種生肉材料分別用絞肉機絞碎，按照每個實驗步驟的要求，將肉品按照一定比例混合;2U Taq DNA聚合酶 大連寶生物公司;Pico－GreenTM雙鏈DNA定量試劑盒 購于荷蘭Molecular Probes公司。

FL×800微型模塊熒光接受器 美國Bio－Tek儀器公司;收集到的信號采用KC4(2000)軟件 美國Bio－Tek儀器公司;Biometra? PCR 德國Biometra公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 肉制品混合物DNA的提取參考Sambrook等［9］的方法，將提取的 DNA保存在 TE(10mmol/L Tris－HCl pH8，0.1mmol/L EDTA)溶液中［10］，用以后續PCR實驗中的模板。

采用Pico－GreenTM雙鏈DNA定量試劑盒對DNA模板定量，FL×800微型模塊熒光接受器接受熒光信號對其進行檢測，收集到的信號采用KC4(2000)軟件分析。根據DNA分子的質量和平均大小來計算DNA摩爾數。

1.2.2 CSP－M－PCR原理及反應體系 在此研究中，CSP引物序列根據雞肉、牛肉、羊肉和豬肉線粒體細胞色素b DNA序列保守區設計［11］，以作為PCR反應的上游引物。將設計好的CSP序列連接在種屬特異性下游引物的5'端，以作為CSP－M－PCR反應體系中的下游引物(記為種屬特異性引物－R)，具體的引物序列見表1。每個引物對經過Biometra? PCR選擇出最合適的退火溫度。

在CSP－M－PCR反應體系中，加入的引物有:CSP、雞－R、牛－R、羊－R 和豬－R。其中:CSP是根據以上四種肉品線粒體細胞色素b DNA序列保守區而設計的，因此對雞、牛、羊和豬的DNA片段都能結合進行擴增。在反應的前幾個循環，主要是作為上游引物的CSP和下游引物中的種屬特異性引物－R與DNA片段發生特異性結合進行擴增，得到片段大小不同的產物。當5'端連有CSP的下游引物用完之后，擴增產物得到一定程度的積累，下游片段也擴增出含有CSP互補的序列，此時，CSP既可以作為上游引物也可以作為下游引物，以得到的產物為模板進行序列擴增，即可得到由通用單引物CSP擴增的片段大小不同的目的條帶［12］。在實驗過程中，首先通過兩組對比實驗，對此原理的可行性進行了驗證，即一組PCR反應體系加入CSP上游引物和普通特異性下游引物，另一組PCR體系加入CSP上游引物和特異性下游引物－R。

反應體系為 30μL，其中包含:10mmol/L Tris－HCl(pH 8，50mmol/L KCl)、l.5mmol/L MgCl2、dNTP mix(每個堿基為50μmol/L)、引物、2U Taq DNA聚合酶和適量的模板，其余體積用雙蒸水補齊。將混合引物設置在不同的比例來優化反應步驟和退火溫度。擴增結束后，取12μL擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠電泳中進行分離。

1.2.3 引物靈敏度測試 在此部分的研究中做對比實驗，以測試通用單引物的靈敏度。兩組PCR反應的條件相同，熱混環條件根據引物的退火溫度進行優化。

CSP和種屬特異性引物的比例分別為 1∶1、1∶0.1、1∶0.01 和 1∶0.001(其中“1”為 0.5mmol/L);CSP和種屬特異性引物－R的比例與之相同。以四種肉制品的等量混合物中提取的DNA作為模板，體系中模板的加入量為10ng。

1.2.4 優化CSP－M－PCR反應體系 分別將四種肉制品中的1種到4種混合，提取的混合肉制品的DNA，并且作為PCR反應的模板，依次進行單重到四重CSP－PCR，模板的加入量為10ng。通過改變引物CSP、雞－R、牛－R、羊－R 和豬－R 加入的比例優化反應體系中引物的加入量，擴增的熱循環條件與1.2.3優化的結果相同。

1.2.5 CSP－M－PCR反應檢測限的測試 為了測試CSP－M－PCR反應對單一肉品的檢測限，將四種肉品按一定比例混合(將0.1g/kg牛肉和50g/kg羊肉，0.5g/kg牛肉和10g/kg羊肉，2g/kg牛肉和2g/kg羊肉，10g/kg牛肉和0.5g/kg羊肉，50g/kg牛肉和0.1g/kg羊肉與其它兩種等質量混合的肉品按一定比例再混合)，使得混合物中的牛肉所占的比例依次為0.1、0.5、2、10和50g/kg，提取混合物的基因組作為 PCR反應模板，加入量為10ng。CSP－M－PCR反應熱循環條件同1.2.4。因每種生肉在CSP－M－PCR反應中所占的比例都不同，所以能得到顯著不同的擴增效率，因此可以測試該反應體系的檢測限。

2 結果與討論

2.1 CSP－M－PCR反應可行性驗證

經過一系列實驗過程的優化，最終確定PCR擴增反應的熱循環條件為:95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸 30s，35 個循環，最后 72℃延伸 10min。引物濃度為15pmol。由圖1、圖2可知，每對引物都可得到相應的目的條帶，沒有非特異性條帶出現，而且二者的擴增效率相似。引物CSP和種屬特異性引物－R得到的產物較CSP與種屬特異性引物的產物片段大38bp，是由于種屬特異性引物－R的5'端連接著與CSP相同的一段序列(38bp)，因此得到的目的片段較后者大。

圖1 CSP和種屬特異性引物可行性驗證

圖2 CSP和種屬特異性引物－R可行性驗證

2.2 引物靈敏度測試

種屬特異性引物和種屬特異性引物－R的靈敏度測試采用含有豬肉和雞肉混合物的二次抽樣方法進行測試。反應的熱循環條件為:95℃變性30s，退火溫度為 70℃ 10s、60℃ 30s，72℃延伸 30s;95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，25 個循環，最后72℃延伸10min。結果如圖3、圖4所示。

由圖3～圖4可知，當特異性下游引物濃度降低到5μmol/L時，已經得不到可見的目的條帶，隨特異性下游引物濃度的減少，擴增效率依次降低。而當特異性引物－R的濃度降低到5μmol/L，依然可以得到清晰的目的條帶。因此，CSP－M－PCR反應的靈敏度有顯著地提高。

圖3 CSP與豬肉特異性引物靈敏度測試

圖4 CSP與雞肉特異性引物靈敏度測試

2.3 CSP－M－PCR反應體系優化

為了找到最佳CSP－M－PCR的反應體系，進行單重到四重PCR進行優化。其中單重和二重PCR反應結果見圖5，三重和四重CSP－PCR的結果如圖6所示。經過優化的結果為:引物CSP、雞－R、牛－R、羊－R 和豬－R 的加入比例為 1∶0.01∶0.01∶0.01∶0.01(其中“1”為0.5mmol/L)。

2.4 CSP－M－PCR對肉品的檢測限

測試CSP－M－PCR反應體系中對四種肉品混合物的檢測限，將雞肉、牛肉、羊肉和豬肉按不同比例混合，可以得到每種肉DNA的不同混合物，即每種肉品的擴增效率也不同，由此可以得到CSP－M－PCR的檢測限，結果如表2所示。

圖5 單重及二重CSP－PCR反應

圖6 三重和四重CSP－PCR反應

表2 CSP－M－PCR反應對肉品的檢測限

由表2可知，當實驗2和4號之間時，都能得到可見的目的條帶，而當牛羊肉中有一種的質量比例在0.5g/kg以下時，都得不到相應的目的片段。由此可知，此反應體系對單一肉品的最低檢測限為0.5g/kg。

3 結論

本文研究出一種同時檢測多種肉品的新技術，即通用單引物多重PCR。在此反應中，通用引物CSP的設計是至關重要的，因為引物對特異性和Tm值的要求要比普通PCR嚴格。經過一系列反應條件的優化，得出最佳的反應熱循環條件為:95℃變性30s，退火溫度為 70℃ 10s、60℃ 30s，72℃ 延伸 30s;95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃ 延伸 30s，25 個循環，最后72℃延伸10min。在反應的前10個循環，主要是CSP做為上游引物，種屬特異性引物－R做為下游引物進行特異性擴增。當種屬特異性引物－R用盡后，得到的目的片段上也有與CSP互補的片段，CSP也可以做為下游引物進行單重PCR擴增。優化的反應條件不僅能夠降低錯配率，而且能提高反應的靈敏度。

CSP－M－PCR反應中，當加入的特異性引物量降低到5μmol/L，已看不到清楚的目的條帶，而當加入的下游引物為特異性引物－R時，雖然含量為5μmol/L，依然可以得到可見的目的條帶，大大地節約了新型引物的加入量，而且消除了不同特異性引物之間性質的差異。

如何在短時間內更多地檢測到肉品的種類和摻假摻雜情況，一直是我國學者重點研究的對象，這不僅關乎到經濟和合理的市場監管問題，也涉及到宗教和健康等問題。CSP－M－PCR這種新方法不僅滿足了快速檢測和較低的檢測限，而且成本還較低，為我國的新型檢測技術提供了許多參考價值。

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Novel common single primer multiplex PCR for detecting various meat species simultaneously

SHANG Ying1，XU Wen－tao1，2，*，YUAN Yan－fang2，LIANG Zhi－hong2，SHI Hui1，ZHAI Zhi－fang1，ZHANG Ya－nan2，LUO Yun－bo1，2，HUANG Kun－lun1，2，*

(1.College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.The Supervision，Inspection ＆ Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

Nowadays in the market，add cheap pork into beef or mutton，sell seconds at best quality prices always happen.In recent years，since the emergence of some diseases，such as mad cow disease，avian flu and so on，meat species identification becomes more and more critical.With in－depth study of molecular biology，multiplex PCR technology has made a rapid development，however，the low amplification efficiency and detection limit don’t live up to the satisfactory requirements.In order to find a quick，sensitive and specific detection of meat species，a novel common single primer multiplex PCR(CSP－M－PCR)technique on the basis of traditional multiplex PCR was developed.In the system of this method，only use common single primer to amplify all of the templates，the limit of detection is 5μmol/L target DNA.This technology not only makes up the shortcomings of traditional multiplex PCR，but also enhances the detecting sensitivity and reduces test costs.

multiplex PCR;common single primer;simultaneous detection;meat species

TS207.5

A

1002－0306(2011)09－0416－04

2010－09－15 *通訊聯系人

商穎(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品安全。

國家高技術研究發展計劃(863)項目(2006AA10Z440);國家自然基金(30800770)和轉基因生物重大專項(2008ZX08012－001)。