產2-酮基-D-葡萄糖酸菌Serratiasp.BK-98的分離及其培養條件優化

張 煒，謝志鵬，張建國

（浙江大學生物化學研究所，浙江杭州310058）

產2-酮基-D-葡萄糖酸菌Serratiasp.BK-98的分離及其培養條件優化

張 煒，謝志鵬，張建國*

（浙江大學生物化學研究所，浙江杭州310058）

從土壤中分離得到一株2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KDG）產生菌，綜合16S rDNA序列和系統進化分析確定該菌屬于沙雷氏菌屬（Serratia），命名為Serratia sp.BK-98。 采用Plackett-Burman（PB）實驗設計，從影響2-酮基-D-葡萄糖酸生物合成條件的14個因素中篩選出具有顯著效應的3個因子：裝液量、發酵時間和初始pH。在此基礎上通過中心組合設計實驗（central composite design,CCD）和響應面分析（response surface methodology,RSM）確定了裝液量、發酵時間和初始pH的最適值分別為6.6mL、57.9h和5.0。在優化條件下，2-KDG的100mL搖瓶發酵產量達到了187.8g/L，100L發酵罐產量達到了192.2g/L，分別較優化前提高了142.6%和148.3%，這兩個實驗結果均與模型的預測值191.4g/L非常接近。

培養條件，2-酮基-D-葡萄糖酸，優化，響應面法，Serratia sp.BK-98

2 -酮基-D-葡萄糖酸（2-KDG）有著廣泛的用途，它能被用作食品添加劑、水泥增塑劑、洗滌劑，是照片顯影劑的重要成分[1]；同時它也是除草劑[2]、D-核酮糖、D-阿拉伯糖，特別是D-異抗壞血酸合成過程中的重要前體[3]。2-KDG的生產方法主要有三種：發酵法、化學合成法和酶促法。由于微生物發酵法生產2-KDG具有操作簡單、副產物少、生產成本低、反應條件溫和、綠色環保等優點而備受國內外研究人員的青睞。自1935年Bernhauer和G?rlich[4]從葡萄糖酸桿菌（Bacterium gluconicum）的發酵液中分離出2-KDG以來，許多具有2-KDG生產能力的菌株相繼被報道，如熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）[5]，粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）[6]，產酮產堿菌（Alcaligenes ketogenes）[7]。合適的培養條件對提高發酵產物的產量至關重要。響應面分析法是20世紀中后葉發展起來的優化實驗條件統計學方法，相比傳統的單因子和正交實驗設計，響應面分析法具有實驗次數少、周期短，求得的回歸方程精度高、能研究幾種因素間交互作用等優點，優化效率高，在微生物培養條件優化方面已有廣泛應用[8-10]。本文從土壤中篩選得到一株具有生產2-KDG能力的菌株，結合16S rDNA序列和系統進化分析表明該菌屬于沙雷氏菌屬（Serratia），以此菌株為出發菌株，采用響應面法（response surface methodology，RSM）對其培養條件進行優化。首先采用Plackett-Burman（PB）設計篩選出影響沙雷氏菌發酵的重要因素，然后通過中心組合設計實驗（central composite design，CCD）和響應面分析對這些重要因素進行優化，確定最佳的發酵條件，為后續放大實驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

篩選培養基（g/L） 葡萄糖200，酵母膏5，自然pH；固體培養基（g/L） 葡萄糖200，酵母膏5，瓊脂20，自然pH；種子培養基（g/L） 葡萄糖10，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3，MgSO4·7H2O 3，pH=6.7；初始發酵培養基 （g/L） K2HPO40.7，KH2PO40.7，MgSO4·7H2O 0.3，葡萄糖200，工業魚蛋白胨19，尿素1.5，CaCO350，pH=6.7。所有培養基滅菌條件均為115℃滅菌20min。

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1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離和鑒定 將從浙江省杭州市收集的菜園土壤放入盛有篩選培養基的搖瓶中，在30℃，250r/min搖床中培養72h，然后根據稀釋平板法將培養液涂布在盛有固體培養基的平板中，30℃培養48h。將得到的單菌落保藏，并篩選2-KDG產量最高的菌株。根據該菌株的16S rDNA基因中的特異保守序列設計PCR引物，擴增該菌株的16S rDNA基因，通過測序并用CLUSTALW 1.6.A軟件將序列與Eztaxon（http://www.eztaxon.org/）中已知16S rDNA序列進行多序列比對，然后根據鄰接法用MEGA 4.0構建系統發育樹，初步確定該菌株在分類學中的位置。

1.2.2 培養條件 種子培養條件：將保藏的斜面菌種接種到盛有25mL種子培養基的100mL搖瓶中，在28℃，250r/min搖床中培養21h。優化前的發酵培養條件：取種子培養液以7%（v/v）接種量接入盛有20mL發酵培養基的100mL搖瓶中，在28℃，230r/min搖床中培養62h。

1.2.3 實驗設計

表1 PB實驗各因素水平

表2 N=20的PB實驗設計與結果

1.2.3.1 PB設計 影響2-KDG產量的可能因素有K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、工業魚蛋白胨、尿素、CaCO3等的濃度，以及接種量、溫度、裝液量、發酵時間、初始pH、種齡、搖床轉速等。實驗選用N=20的PB設計安排，對這14個因素進行研究，另設4個因素為虛擬變量，用于估計誤差，實驗設計的每個因素取兩個水平，根據前期實驗來確定，各因素水平取值見表1，實驗設計表見表2。所有實驗重復三次，最后取平均值。

1.2.3.2 中心組合設計 根據PB設計實驗篩選出的具有顯著效應的因素，采用中心組合設計實驗進行優化，實驗設計表見表3。所有實驗重復三次，最后取平均值。采用軟件Minitab 15.0進行實驗設計和數據分析。

表3 中心組合實驗設計與結果

1.2.4 2 -KDG的分析方法 2-KDG的定性分析采用薄層層析（TLC）法：展開劑為吡啶:乙酸乙酯∶乙酸∶水（5∶5∶1∶3，v/v），顯色劑為0.2%鄰苯二胺酒精溶液（含1%濃硝酸）[11]，硅膠板在使用前先在105℃烘箱中烘20min。

2 -KDG的定量測定采用高效液相色譜法（HPLC）：參考文獻[12]。

2 結果與討論

2.1 產2-KDG菌株的分離和鑒定

從土壤中分離出來的單菌落經過搖瓶培養后先用TLC篩選出能產2-KDG的菌株，之后再用HPLC篩選出2-KDG產量最高的菌株BK-98用于進一步的優化實驗。測序結果表明該菌株的16S rDNA片段約1456bp，16S rDNA基因序列在GenBank的登錄號HM565931。將該序列與Eztaxon（http://www.eztaxon.org/）中已知16S rDNA序列進行多序列比對，構建以16S rDNA序列為基礎的系統發育樹（圖1）。結果表明，BK-98與沙雷氏菌屬（Serratia）同源性很高，與Serratia nematodiphila同源性更是達到99.656%（GenBank登錄號EU036987）。因此，可以初步確定BK-98屬于沙雷氏菌屬（Serratia），并將該菌株命名為Serratiasp.BK-98。

圖1 鄰接法構建的基于16S rDNA基因序列的菌株Serratia sp.BK-98與相關菌株的系統發育樹，括號里的數值為Genbank登錄號，分支處的數值為自展值

2.2 PB實驗設計篩選重要因素

采用PB實驗設計從眾多影響Serratiasp.BK-98發酵的因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，供進一步研究用。PB實驗結果見表2。對表2的實驗結果進行回歸分析，分析結果見表4。

表4 PB實驗設計的回歸分析

由表4可知，此回歸模型的決定系數R2為97.99%，表明模型構建非常成功。由表1可知，對2-KDG發酵過程有顯著影響的因素有裝液量、發酵時間、初始pH、搖床轉速和溫度，它們的效應分別為47.54，30.44，25.84，24.18和12.18。其中裝液量、初始pH和溫度對產2-KDG的影響呈現出負效應,發酵時間和搖床轉速對產2-KDG的影響呈現出正效應。圖2進一步顯示了各個因素的顯著性水平。由于三個以上的因素會大量地增加CCD實驗的次數，一般選擇不超過三個的因素做CCD實驗[13]。故本文選擇影響效應最大的三個因素（裝液量，發酵時間和初始pH）進行CCD實驗。搖床轉速和溫度兩個因素則根據正負效應水平，搖床轉速取高水平值，溫度取低水平值。

圖2 影響2-KDG產量的14個因素效應的帕累托圖

2.3 RSM法優化2-KDG發酵條件

采用中心組合實驗設計確定三個顯著因素（裝液量、發酵時間和初始pH）的最優水平，實驗結果見表3。對所得的實驗結果進行多元回歸分析得到以下二次多項式模型：

其中Y代表2-KDG的產量，C、E和F分別代表裝液量、發酵時間和初始pH。

回歸模型的方差分析見表5，F檢驗P=0.000說明回歸在統計學上是非常顯著的，同時，該模型失擬項的P值大于0.05，說明該模型失擬不顯著。此外，該模型的決定系數R2=0.9717，說明回歸方程的擬合程度很好，可以應用于Serratia sp.BK-98發酵生產2-KDG的分析和預測。

表5 二次多項式模型的方差分析

回歸模型中各項的系數估計見表6，從表6可知，一次項中C和E對2-KDG發酵有顯著影響，二次項中CF對2-KDG發酵有顯著影響，其余項對2-KDG發酵的影響不顯著。響應面圖3～圖5直觀地反映了各個因素對響應值的影響。圖3說明裝液量對2-KDG產量的影響極大，當裝液量增大時，2-KDG產量迅速減少。這個實驗結果與Misenheimer等人[6]的報道一致。從圖中可以看出當裝液量為10mL時，2-KDG的產量為175.1g/L，當裝液量為20mL時，2-KDG的產量快速減少為106.3g/L。這可能是因為裝液量過大，溶氧濃度迅速下降，當發酵液中的溶氧濃度降至臨界氧濃度以下，糖代謝受到了顯著的影響。圖4表明發酵時間也顯著地影響2-KDG產量。當發酵時間大于68h，隨著發酵時間的延長，2-KDG產量明顯增加。圖5反映了初始pH和裝液量的交互效應。初始pH和裝液量均與2-KDG產量呈現負相關，2-KDG產量隨著初始pH和裝液量的減少而顯著增加。

用Minitab軟件求解方程得到裝液量、發酵時間和初始pH的最佳條件分別為6.6mL，57.9h和5.0。在此最佳條件下，模型預測的2-KDG產量為191.4g/L。

表6 CCD實驗設計的回歸分析

圖3 C和E對2-KDG產量影響的響應面圖

圖4 E和F對2-KDG產量影響的響應面圖

圖5 C和F對2-KDG產量影響的響應面圖

2.4 模型驗證

為了檢驗模型的準確性，在優化條件下進行驗證實驗，經三批100mL搖瓶培養重復實驗，所得的2-KDG產量平均值為187.8g/L；此外，進一步在100L發酵罐上進行了三批重復實驗，根據RSM優化結果可知Serratia sp.BK-98在發酵生產2-KDG過程中需氧量較大，故設定通氣量為4.0m3/h，罐壓為0.05MPa，裝液量為55L，通過轉速與溶氧串級使整個發酵過程中溶氧維持在10%以上，其他條件同搖瓶實驗，最終2-KDG產量平均值為192.2g/L。搖瓶與發酵罐的實驗值均與理論預測值非常接近，可見該模型可以較好地預測實際發酵情況。

3 結語

本文從土壤中分離篩選得到一株能產2-KDG的菌株，綜合16S rDNA序列和系統進化分析確定該菌屬于沙雷氏菌屬（Serratia），并將該菌株命名為Serratia sp.BK-98。本文采用PB實驗設計與響應面法相結合的方法優化Serratia sp.BK-98產2-KDG的發酵條件，從眾多的影響因子中快速有效地篩選出主要影響因子并實現其水平的優化。優化后的Serratia sp.BK-98產2-KDG的最佳發酵條件為：裝液量6.6mL，發酵時間為57.9h，初始pH為5.0，接種量7%（v/v），溫度26℃，種齡21h，搖床轉速260r/min，K2HPO40.7g/L，KH2PO40.7g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，葡萄糖200g/L，工業魚蛋白胨19g/L，尿素1.5g/L，CaCO350g/L。在此優化條件下，經過三批100mL搖瓶培養重復實驗，所得的平均值為187.8g/L，進一步的三批裝液量為55L的100L發酵罐重復實驗，所得的平均值為192.2g/L，兩者的實驗結果均與模型的預測值191.4g/L十分接近，與優化前的原始發酵條件下2-KDG的產量77.4g/L相比，搖瓶和發酵罐的2-KDG產量分別提高了142.6%和148.3%，這為進一步的發酵放大實驗和工業化應用奠定了良好的基礎。

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Optimization of culture conditions for producing 2-keto-D-gluconic acid by an isolated strain of Serratia sp.BK-98

ZHANG Wei,XIE Zhi-peng,ZHANG Jian-guo*

（Institute of Biochemistry,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

A strain capable of producing 2-keto-D-gluconic acid (2-KDG)was isolated from soil.The phylogenetic analysis based on 16S rDNA suggested the isolate was assigned to genus Serratia and named Serratia sp.BK-98.Medium loading volume，fermentation time and initial pH were found to be most significant factors affecting 2-KDG production using Plackett-Burman (PB)design and their values were optimized to be 6.6mL in a 100mL Erlenmeyer flask of medium loading volume，57.9h of fermentation time and 5.0 of initial pH respectively with response surface methodology(RSM)based on central composite design (CCD).Under the optimized fermentation conditions，2-KDG production in a 100mL Erlenmeyer flask and in a 100L fermenter reached 187.8g/L and 192.2g/L respectively，142.6%and 148.3%increase respectively as compared with the pre-optimized conditions.A close agreement with the predicted value of 191.4g/L indicated that the proposed relationship model between the impact factors and 2-KDG production was very practical.

culture conditions； 2-keto-D-gluconic acid； optimization； response surface methodology； Serratia sp.BK-98

TS201.3

A

1002-0306（2011）10-0264-05

2010－09－28 * 通訊聯系人

張煒（1986-），男，碩士研究生，研究方向：發酵工程。