非小細(xì)胞肺癌中DPC4基因的表達(dá)與bcl-2及VEGF之間的關(guān)系

何 玲 ，尚麗娜 ，楊 磊 ，李曉琴 ，李 敏

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

非小細(xì)胞肺癌中DPC4基因的表達(dá)與bcl-2及VEGF之間的關(guān)系

何 玲1，2，尚麗娜2，楊 磊2，李曉琴3，李 敏1

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

目的研究DPC4（Deleted in Pancreatic Carcinoma Locus 4，DPC4）基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與凋亡抑制蛋白bcl-2及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的關(guān)系。方法利用免疫組織化學(xué)SP法檢測65例非小細(xì)胞肺癌組織和18例癌旁正常肺組織中DPC4、bcl-2和VEGF的表達(dá)。結(jié)果DPC4在非小細(xì)胞肺癌中的陽性率為50.8%（33/65），在癌旁正常肺組織中的陽性率為77.8%（14/18），2者之間的比較有顯著性差異（P<0.05）；DPC4與性別、年齡及病理類型無關(guān)（P>0.05），但與非小細(xì)胞肺癌的分期、分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.05）；65例非小細(xì)胞肺癌中，DPC4的表達(dá)與bcl-2、VEGF均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論DPC4基因的缺失可能與非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展如分期、分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，DPC4基因的缺失可能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡并上調(diào)VEGF表達(dá)來促進(jìn)血管的生成。

DPC4；非小細(xì)胞肺癌；免疫組織化學(xué)；VEGF；bcl-2

DPC4(Deleted in Pancreatic Carcinoma Locus 4)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑制基因，在胰腺、膽道、結(jié)腸等胃腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其蛋白產(chǎn)物Smad4介導(dǎo)對TGF-β家族的應(yīng)答，在TGF-β受體信號傳遞途徑中具有重要的作用。但DPC4在肺癌中的表達(dá)與凋亡抑制蛋白bcl-2及VEGF之間的關(guān)系到目前為止還不甚清楚。本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測了65例肺癌組織和18例相應(yīng)的癌旁正常肺組織DPC4基因的蛋白表達(dá)，以探討其在肺癌發(fā)病機制中的作用及其與凋亡抑制蛋白bcl-2及VEGF之間的關(guān)系，為今后以DPC4基因為靶點對肺癌進(jìn)行基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

65例肺癌標(biāo)本及18例癌旁正常組織均為甘肅省腫瘤醫(yī)院2008年5月～2010年3月經(jīng)病理證實的手術(shù)切除組織。65例肺癌患者中，男50例，女15例，年齡32～81歲，平均年齡為60歲。其中鱗癌38例，腺癌27例；高分化癌17例，中分化癌34例，低分化癌14例；有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者31例，無轉(zhuǎn)移者34例。18例癌旁正常組織為對照組。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，并進(jìn)行HE染色。

1.2 試劑和方法

鼠抗人DPC4、bcl-2和VEGF單克隆抗體購自Maxim-Bio公司，均為即用型。免疫組織化學(xué)SP試劑盒為北京中杉金橋產(chǎn)品。實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行，PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性片作陽性對照，用DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

DPC4、bcl-2和VEGF免疫組織化學(xué)結(jié)果以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。顯微鏡下觀察DPC4、bcl-2和VEGF蛋白的分布、陽性強度和陽性率。先按染色強度打分:0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強度需與背景著色相對比；再按陽性細(xì)胞所占百分比打分:0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%，染色強度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≥2分為免疫反應(yīng)陽性（+）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，DPC4的表達(dá)與不同臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗，DPC4和bcl-2、VEGF的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 DPC4、bcl-2和VEGF在肺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

DPC4陽性表達(dá)主要定位在癌旁正常組織的氣管上皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)上（見圖1、圖2）。癌旁正常組織及癌組織的陽性率分別為77.8%（14/18）和50.8%（33/65），癌旁正常組織中DPC4的表達(dá)明顯高于癌組織（P<0.05）。bcl-2和VEGF的陽性表達(dá)主要定位在細(xì)胞胞質(zhì)（見圖3、圖4）。肺癌組織中VEGF、bcl-2陽性表達(dá)率分別為80.2%（53/65）和53.8%（35/65），癌旁正常組織中VEGF、bcl-2 陽性表達(dá)率分別為 44.4%（8/18） 和 11.1%（2/18），肺癌中VEGF、bcl-2的陽性表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（P<0.05）。

圖1 DPC4在癌旁正常肺組織中呈高表達(dá)（SP×100）

圖2 DPC4在中分化肺鱗癌組織中呈低表達(dá)（SP×200）

圖3 bcl-2在高分化肺腺癌中呈陽性表達(dá)（SP×200）

圖4 VEGF在高分化肺腺癌中呈陽性表達(dá)（SP×40）

2.2 肺癌中DPC4的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（見表1）

表1 DPC4的表達(dá)與肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

由表1可知，65例肺癌組織中Ⅰ-Ⅱ期的肺癌組織中DPC4的陽性率顯著高于Ⅲ-Ⅳ期肺癌組織（P<0.05），而且隨著分化程度的降低，DPC4的陽性率逐漸降低，2者之間的比較有極著性差異（P<0.01）。65例肺癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組DPC4陽性率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.05）。肺癌中DPC4表達(dá)在患者的性別、年齡、病理類型間比較，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 肺癌中DPC4表達(dá)與bcl-2及VEGF表達(dá)之間的關(guān)系（見表2）

表2 肺癌中DPC4表達(dá)與bcl-2及VEGF表達(dá)之間的關(guān)系

對65例肺癌組織中DPC4、bcl-2及VEGF表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行重新賦值，陰性（-）為1、陽性（+）為 2，將DPC4分別與 bcl-2和VEGF進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。結(jié)果顯示，DPC4與bcl-2（P<0.05）及 VEGF（P<0.05）均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討論

大量研究表明，DPC4基因的缺失在胰腺癌、結(jié)直腸癌以及肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用[1～2]。本研究顯示，65例非小細(xì)胞肺癌中DPC4的表達(dá)率為50.8%，與正常肺組織中的表達(dá)相比顯著降低（77.8%），提示DPC4的低表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生有關(guān)，此結(jié)果與Bai等[3]的研究結(jié)果相同。Gregory等[4]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中Smad4蛋白的表達(dá)與腫瘤的分級以及分期有關(guān)，分化越差的前列腺癌，其DPC4(Smad4)缺失率越高。Maitra等[5]通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)法對不同分期的結(jié)直腸癌組織標(biāo)記DPC4后，發(fā)現(xiàn)DPC4的功能缺失可能是在結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展的后期發(fā)生的，本研究顯示DPC4與非小細(xì)胞肺癌組織的分級、分期明顯相關(guān)，分化越差分期越高的肺癌組織，其DPC4的表達(dá)越低。同時，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組中DPC4陽性率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組,這些結(jié)果提示DPC4的失活可能發(fā)生在腫瘤進(jìn)展的后期，屬于晚期分子事件，并且可能參與了腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的過程。這一結(jié)果與Barbera等[6]的報道相同。

DPC4是TGF-β家族的直接酶底物，它具有抑制細(xì)胞生長，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等多種功能[7]。Kolek等[8]發(fā)現(xiàn)在HC11鼠乳腺上皮細(xì)胞中TGF-β1能夠通過線粒體途徑使bax活化和易位，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。同時研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在閉鎖卵泡細(xì)胞[9]、人晶狀體上皮細(xì)胞[10]、多能造血細(xì)胞[11]、人卵巢癌細(xì)胞[12]、結(jié)直腸癌細(xì)胞[13]中介導(dǎo)凋亡時會出現(xiàn)bcl-2水平的降低。bcl-2作為凋亡抑制蛋白對調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡具有關(guān)鍵性作用。但是DPC4與bcl-2之間到底是什么關(guān)系，到目前為止還不清楚。本研究結(jié)果顯示，bcl-2與DPC4之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示DPC4可能在TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中具有重要的作用，這與Ke等[14]的結(jié)論一致。TGFβ1在細(xì)胞凋亡的啟動過程中具有重要的作用，而DPC4作為TGF-β2信號通路中的重要傳導(dǎo)分子,其低表達(dá)會影響TGF2β促凋亡信號的傳導(dǎo),從而使凋亡細(xì)胞數(shù)降低。王春雷等[15]也證實DPC4能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是一種高度特異的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加微血管通透性以及誘導(dǎo)血管生成，而且它在病理性血管生成過程中也具有中心調(diào)控作用，是腫瘤細(xì)胞分泌的血管形成因子中最重要的一種，也是目前已知的功能最多、作用最強的促血管生成因子之一[16]。它與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。有報道表明，TGF-β1具有活化血管生長因子的作用，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在微血管塑形中具有重要的作用[17]。Schwarte-Waldhoff等[18]在研究胰腺癌時發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)DPC4的重新表達(dá)抑制了腫瘤的形成,但是TGF-β卻沒有這樣的作用。同時，DPC4還可以通過減少VEGF的表達(dá)，增加血管形成抑制因子血小板反應(yīng)蛋白21(TSP21)的表達(dá)來抑制血管的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，DPC4與VEGF呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，DPC4陽性的肺癌組織中VEGF陽性率明顯低于DPC4陰性的肺癌組織，提示DPC4基因的缺失可能參與VEGF促進(jìn)血管生成的機制。

綜上所述，DPC4的失活可能與非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展如分期、分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，DPC4基因的缺失可能抑制肺癌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其表達(dá)VEGF，從而使得肺癌逐漸向惡性進(jìn)展并最終轉(zhuǎn)移。

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1671-1246（2011）04-0078-03