甘肅省漢族、回族人非綜合征唇腭裂與轉化生長因子-α的基因多態性相關性研究

張志瑞，陳莉婭，任衛萍，楊 芒

（1.蘭州大學第一醫院口腔科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院口腔科，甘肅 蘭州 730000）

甘肅省漢族、回族人非綜合征唇腭裂與轉化生長因子-α的基因多態性相關性研究

張志瑞1，陳莉婭1，任衛萍2，楊 芒1

（1.蘭州大學第一醫院口腔科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院口腔科，甘肅 蘭州 730000）

目的研究甘肅省漢族和回族人非綜合征唇腭裂與轉化生長因子-α（Transforming Growth Fator-α，TGF-α）基因多態性的相關性。方法 采用聚合酶鏈反應——限制性酶切片段長度多態（PCR-RFLP）的方法對50例漢族非綜合征唇腭裂患者與25例正常漢族人，50例回族非綜合征唇腭裂患者與18例正常回族人進行TGF-α基因檢測分析。結果甘肅省漢族、回族非綜合征唇腭裂（NSCL/P）患者的C2等位基因頻率較正常人明顯增高，2組比較有顯著性差異（P<0.05），漢族和回族人NSCL/P患者等位基因頻率、基因型均無顯著性差異。結論TGF-α基因多態性與甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂的發生有關聯。

甘肅省漢族、回族人；非綜合征唇腭裂；轉化生長因子-α；基因多態性

唇腭裂是口腔顏面部最常見的發育畸形，常伴發牙頜系統畸形，是一種復雜的、由遺傳和環境因素相互作用所致的多基因、多因素遺傳病。而非綜合征唇腭裂（NSCL/P）是指不伴有全身其他疾病的單純的唇裂或腭裂與唇裂伴腭裂。國內外研究證明，遺傳因素在非綜合征唇腭裂的發病因素中占有舉足輕重的地位。由于唇腭裂病因的復雜性、遺傳模式的不確定性、不同地區甚至不同表型NSCL/P的候選基因存在差異，有大量的研究數據表明，唇腭裂的發生存在人種、地域的差異。

本研究通過采用聚合酶鏈反應——限制性酶切片段長度多態（PCR-RFLP）的方法，對甘肅省50例漢族非綜合征唇腭裂患者與25例漢族正常人，50例回族非綜合征唇腭裂患者與18例回族正常人進行TGF-α的研究，進一步探究TGF-α基因與甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂發生的相關性。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器

PCR擴增試劑盒（天根生物公司生產），限制性內切酶、耐熱DNA多聚酶、DNA Marer、瓊脂糖為Promega公司產品，血液DNA提取試劑盒及淋巴細胞分離液（均購自上海生工生物公司），TGF-α基因TaqI限制性片段多態性特異性PCR擴增引物[1]，上游引物為：5’-TCA CTTCCC CTT TTTCATCTG-T-3’，下游引物為：CGA GGA GGC TCTGAG GTG-3’。Gerpro凝膠自動分析和成像系統、ABI9700PCR擴增儀（美國制造），水平離心機（北京醫學離心機廠制造），Heraeus低溫高溫離心機（德國制造）。

1.2 病例選擇

非綜合征唇腭裂患者均為在甘肅省內長期居住并參加了蘭州大學第一醫院口腔頜面外科“微笑行動”與“微笑列車”活動的患者。選取漢族、回族單純唇裂或單純腭裂或唇裂合并腭裂的非綜合征患者為實驗組，年齡3個月～18歲。對照組均為相應民族正常人志愿者，參試者均在知情同意下進行，且無系統性疾病，近期未服用藥物。

1.3 方法

所有參試者抽取外周血3m l加EDTA抗凝后，嚴格按照純化試劑盒的操作說明提取DNA，用核酸分析儀進行DNA的定量，稀釋后備用。反應體系：PCR總反應體系25μl，其中含待測模板1μl，dNTP 2.5μl，TaqDNA聚合酶1μl及其相應的10xbuffer2.5μl，上、下游引物各1μl，用去離子水補足14μl，2xTapPCR Mastermix（Mgcl2，dNTP，Taq 酶，緩沖液 ）放入 PCR擴增儀內，93℃預變性 3min，93℃變性 30 s，54.5℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，10 個循環，然后 93℃變性 30 s，54.5℃退火 30 s，72℃延伸30 s，22個循環，最后72℃延伸 10min。取PCR產物10μl，加TaqI限制性內切酶8 U及相應的10xbuffer 2μl，0.1%BSA 2μl，65℃水浴酶切6 h以上。電泳分析酶切產物，取15μl酶切產物上樣，在4%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下觀察結果，確定個體的基因型。

1.4 統計學分析

采用SPSS11.0統計軟件處理數據，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 TGF-α基因型分析

PCR擴增產物為一條178 bp（174 bp）片段，經過TaqI酶切后可產生 2條片段（122 bp和 52 bp），3種基因型：（1）C1C1型（正常純合子），僅有178 bp一條片段且不能被酶切；（2）C1C2型（雜合子），酶切后產178 bp、122 bp和52 bp 3條片段；（3）C2C2型（突變純合子），產生122 bp及52 bp 2條片段。

2.2 TGF-α/Taq I基因多態性（見表1）

表1 實驗組與對照組TGF-α的等位基因與基因型的分布頻率

根據電泳結果確定被檢測人員的基因型及基因頻率，如表1所示，漢、回族實驗組與對照組的TGF-α等位基因C2頻率比較有顯著性差異（P＜0.05），而漢、回族人群非綜合征唇腭裂組等位基因頻率無顯著性差異（P＞0.05），C1C1、C1C2、C2C2 基因型頻率無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

近年來研究表明，新生兒畸形率呈上升趨勢，而唇腭裂畸形發生率上升較為迅速，我國的發病率為0.182%[1]。盡管其發病因素不明確，但遺傳和孕期環境因素是目前公認的發病原因，其中基因的多態性變異成為主要的致病因素。TGF-α是一種生長因子，屬于表皮生長因子家族，能刺激上皮細胞的增生并誘導其分化，對許多細胞的生長具有調節作用。在小鼠發育的腭突中，TGF-α得以廣泛表達，該基因可刺激腭突細胞合成細胞外基質，對腭突的生長、上抬和融合都有重要的作用[2]。1989年，Ardinger等[3]首次以高加索人群為研究對象，發現TGF-α基因多態性與非綜合征唇腭裂有顯著的關聯，而Yasushi等[4]的研究也發現，該基因的多態性與NSCL/P的發生存在相關性；Lidra等[5]對菲律賓人群的研究發現，TGF-α與NSCL/P的發生無關聯，國內學者袁奎封[6]的研究表明，TGF-α可能與山東漢族人非綜合征唇腭裂的發生有關，由此可見，TGF-α基因在非綜合征唇腭裂發生中的作用存在人群特異性。本研究采集漢族、回族非綜合征唇腭裂患者及相應民族的健康人對照，分別抽取其外周血，通過分子生物學PCR的方法，分析位于2號染色體上的基因位點[7]——TGF-α與甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂有顯著關聯，而在甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂患者之間無顯著性差異，這說明TGF-α可能是甘肅省漢族、回族人群非綜合征唇腭裂患者的候選基因，但在漢、回族之間并無特異性的選擇，這將為我們今后對唇腭裂發生的候選基因的探究提供參考依據。

[1]史曉泓，唐慧，梁怡.新生兒唇腭裂畸形的致病因素研究進展[J].中國婦幼保健，2006，21（7）：1006～1007.

[2]Dixon MJ，Garaner J，Ferguson MWJ.Immunolocalization of epidermal growth fator（EGF），EGF receptor and transforming growth factor alpha（TGF-a）duringmurine palatogenesis in vivo and in vitro[J].Anat Embryol，1991（18）：83～91.

[3]Ardinger HH，Buetow KH，Bell GI，et al.Association of genetic variation of the transforming growth factor alpha gene with cleft lip and palate[J].Am JHum Genet，1989（45）：348～359.

[4]Yasushi S，Peter A，Jezewski M，et al.In a vietnamese population，MSX1 Variants contribute to cleft lip and palate[J].Genet Med，2004，6（3）：117～125.

[5]Lidral AC，Murray JC，Buetow KH，et al.Studies of the candidate genes TGFB2，MSX1，TGA，andTGFB3 in the etiology of cleft lip and palate in the philippines[J].Cleft Palate Craniofac J，1997（34）：1～6.

[6]袁奎封.轉化生長因子-α基因多態性與山東漢族人非綜合征性唇腭裂的關系[J].華西口腔醫學雜志，2006，24（6）：533～535.

[7]徐濱.染色體基因位點與非綜合征性唇腭裂致病機制的關系[J].國際口腔醫學雜志，2007，34（5）：348～351.

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1671-1246（2011）16-0104-02

Vol.29 2011 No.16

蘭州大學青年基金資助項目（2010-1-12）