新城疫病毒LaSota疫苗株全基因克隆和序列分析

盧艷 趙恒 閆紅巖 司紅麗 何成強 山東師范大學生命科學學院，濟南 250014

新城疫病毒LaSota疫苗株全基因克隆和序列分析

盧艷 趙恒 閆紅巖 司紅麗 何成強 山東師范大學生命科學學院，濟南 250014

本文通過RT-PCR的方法對家禽所的新城疫病毒LaSota疫苗株的全長進行分段克隆，通過測序獲得全長序列，該病毒全長為15186bp，將全長序列提交到NCBI GenBank中獲得序列登錄號為JF950510，將其與之前已提交到NCBI GenBank中的LaSota株全長序列（登錄號為AF077761）比較，核苷酸序列有135處變異，各個蛋白的氨基酸序列總共有61處變異。全基因克隆和序列分析為下一步研究LaSota株提供一個良好的方法。

RT-PCR;新城疫病毒;基因組序列

新城疫( Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一種烈性病毒性傳染病，是當今全球范圍內最嚴重的家禽傳染病之一[1]。包含6個基因，依次為3’-N P-P-M-FH N-L-5’，分別編碼核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基質蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F）、血凝素-神經氨酸酶（hemagglutininneuraminidase，HN）、大聚合酶蛋白（large polymerase protein，L）[2]。本研究對其基因組序列進行測定，這對我國NDV開展分子流行病學和跨種間致病研究提供科學資料，為今后研制有效的NDV疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 病毒及分子生物學相關材料

Ⅳ系La Sota是山東省農科院家禽所袁小遠老師惠贈的。SPF（specific pathogen free，無特定病原體）雞胚購買于山東省農科院。p M D 18-T，T 4連接酶購買于TaKaRa公司， E.coli DH5 α為本實驗室保存，DNA純化回收試劑盒購買于天根公司。

1.2 病毒的純化與收集：用PBS稀釋La Sota疫苗然后接種于9～11日齡的SPF雞胚中擴增并收集病毒，并通過血凝實驗測得病毒效價為9。

1.3 引物設計：根據GeneBank上公布的全基因組序列將全長分別分12段擴增La Sota株基因組，使用primer5設計每個片段的上下游引物。引物序列如表1。

1.4 RNA的提取及RT-PCR：按照TRNzolA+總RNA提取的實驗步驟抽提RNA，按照廠商提供的TransScript twostep RT-PCR supermix說明書提供的方法進行RT-PCR。

1.5 克隆測序：將擴增得到的各個cDNA片段連接到pMD18-T載體，篩選含目的片段的單菌落，陽性克隆送北京華大測序。將測序結果依次拼接后得到全長的基因組序列。

2 結果

2.1 新城疫病毒基因組各片段的克隆和鑒定

利用R T-P C R擴增出了包含了L a Sota全基因序列的12個片段，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測到與預期大小相同的條帶，各片段克隆到pMD18-T載體上，用菌落PCR和測序的方法檢測出陽性克隆。

2.2 NDV La Sota疫苗株全基因組序列測定

我們測通了NDV LaSota疫苗株全基因組各段cDNA陽性克隆，運用DNAstar拼接出全基因組序列，NDV LaSota疫苗株全長15186bp，符合6的倍數。含有6個開放閱讀框，各開放閱讀框的大小分別為：1470bp，1188bp，1095bp，1662bp，1734bp，6615bp。我們將拼接完的La Sota的全基因組序列提交到GeneBank上，基因組序列號為JF950510。用MEGA5.0對這株病毒的全基因組序列和GeneBank上已提交的相應病毒全基因組序列作比對，發現相似性高達99%。有意思的是，在La Sota株的1223 7b p處多出一個堿基G，而在12326bp處則發生了缺失突變，這一變異可能導致30個氨基酸的改變。其他位置的突變有46處。

表1 NDV La Sota基因片段擴增的引物序列

3 討論

在我國，主要是廣泛接種新城疫疫苗來控制該病的爆發，一些減毒株疫苗如新城疫Ⅳ系（LaSota株）、H株、Rokin株、克隆30，等被廣泛用于預防NDV[3]。由于減毒活疫苗易于飲水、噴霧、氣霧等使用相對方便，因此常被用于群體免疫，且NDV免疫密度和次數也遠遠超過世界水平。由于大面積的疫苗使用，新城疫得到了較好的控制，但近些年來，NDV出現了一些新的疫情，即在免疫過的雞群中，即使能產生高的抗體滴度，新城疫仍時有爆發[4]。大量使用的疫苗株難免流失到環境中，目前，那些散落在環境中的疫苗毒株對新城疫病毒本身造成的影響并沒有完全了解。在這里，我們雖然發現了新城疫疫苗株的突變，但是突變后果完全未知，因此我們應該謹慎對待這類新城疫活載體多價疫苗。

本篇論文以家禽所的LaSota疫苗為材料，通過測序得到全長序列。在測序時，我們考慮了PCR過程可能造成基因的變異[5]，故對該病毒基因組的各區段至少測序三次，綜合多次測序結果獲得其全長基因序列，因此所獲得的序列應該能夠真實反映了該病毒株基因組的核苷酸序列。將我們得到的序列與之前已提交到N C B I GenBank中的LaSota株全長序列（登錄號為AF077761）比較，我們發現的核苷酸的變異，說明疫苗株在自然免疫中就不斷發生變異[6]。綜上所述表明新城疫病毒在自然界的選擇壓力與免疫壓力下，其部分生物學特性已經發生變化，這可能是病毒對外界環境變化而發生的一種適應性突變的結果。

這些結果為了解我國新城疫病毒疫苗的現狀提供了新的信息，也為新型疫苗的研制和開發提供了理論依據。

[1]卡爾尼克BW.禽病學[M].第十版.高福等譯.北京:中國農業出版社, 1999.692- 694

[2]徐文．新城疫疫苗的最新研究進展[J].Poultry Science 2008.6:43- 45

[3]王友華．雞新城疫綜合防控措施，動物醫院，2010.3:39-40

[4]雍麗．雞新城疫疫苗應用的研究進展.甘肅畜牧獸醫，2010.1:38-40

[5]Alexander,D.J.Newcastle disease [M].Boston:Kluwer Academic Publishers, 1988.147-160.

[6]施少華．番鴨新城疫病毒全基因組序列分析.2006年學術年會，2010.669-672.

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.22.073

山東省高等學校科技計劃項目（J09LCD209-12）和山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金項目（BS2009NY011）（,BS2010NY029）

盧艷。研究方向：微生物專業；

何成強，學歷：博士，職稱：副教授。