牛黃消炎片微生物限度檢查方法探討

江蘇省泰州市藥品檢驗所（225300）季大偉 錢桂英

藥理實驗證明，牛黃消炎片主要成分大黃和人工牛黃對金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用。《中國藥典》2005年版規(guī)定，具有抑菌活性的藥品進(jìn)行微生物限度檢查時必須消除供試液的抑菌活性后再依法檢查。然而，本研究在日常監(jiān)督檢驗中發(fā)現(xiàn)，僅牛黃消炎片一個品種，不同的生產(chǎn)單位在進(jìn)行微生物限度細(xì)菌計數(shù)檢查時，采用的消除供試液抑菌活性的方法各不相同，給基層監(jiān)督檢驗工作帶來很大困難。本研究旨在對由7個生產(chǎn)單位涉及常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法及薄膜過濾法的牛黃消炎片細(xì)菌計數(shù)檢查方法按《中國藥典》2005年版規(guī)定進(jìn)行再驗證，促進(jìn)以品種確定方法工作的開展。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 HTY-760勻漿儀，PL202-L便攜式電子天平，0412-1型離心機(jī)。

1.2 試劑 培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（稀釋供試品用），0.9%無菌氯化鈉溶液（稀釋菌液用）。

1.3 菌種 大腸埃希菌Escherichia coli[C M C C（B）4 4 1 0 2]，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC（B）26003]，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC（B）63501]，由中國藥品生物制品檢驗所提供，傳代次數(shù)均為三代。樣品信息見附表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液制備 稱取供試品10g，加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀粉碎，混勻，作為1:10的供試液。

2.2 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。2.3 回收率試驗方法 試驗組：①常規(guī)法：取供試液1ml和50～100cfu試驗菌同時加入平皿中，立即傾注15ml～20ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按規(guī)定培養(yǎng)，菌落計數(shù)。每株試驗菌平行制備兩個平皿。②培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml?皿-1）：取供試液1ml按每一平皿0.2ml分置5個平皿中，每一平皿分別加入50～100cfu試驗菌。③離心沉淀集菌、薄膜過濾聯(lián)用法：取供試液10ml置離心管中，500RPM×3min離心后取全部上清液置無菌試管中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補(bǔ)足10ml，再從中取1ml，加適量稀釋劑，依法按薄膜過濾法處理，沖洗量500ml（100ml×5次）。

2.3.2 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。

2.3.3 供試品對照組 除不加試驗菌外，其余操作同試驗組，測定本底菌數(shù)。

2.3.4 回收率（%）=（試驗組菌數(shù)-供試品對照組菌數(shù)）/菌液組菌數(shù)×100%

2.4 方法的確立 為了解樣品的抑菌活性情況，采用常規(guī)法進(jìn)行回收率試驗，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，確定消除抑菌活性的方法并進(jìn)行驗證。預(yù)試驗結(jié)果見附表2。由附表2可知，7個樣品的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的回收率均大于70%；除3號樣品外，其他6個樣品的枯草芽孢桿菌回收率均低于70%，不能采用常規(guī)法進(jìn)行樣品細(xì)菌計數(shù)檢查，故無法把細(xì)菌計數(shù)方法統(tǒng)一為常規(guī)法。針對枯草芽孢桿菌抑制的情況采用②法進(jìn)行回收率試驗，結(jié)果見附表3。由附表3可知，采用②法，除2、3號樣品外，其他5個樣品的金黃色葡萄球菌回收率均低于70%，不能采用②法進(jìn)行樣品細(xì)菌計數(shù)檢查，故無法把細(xì)菌計數(shù)方法統(tǒng)一為培養(yǎng)基稀釋法。針對枯草芽孢桿菌抑制的情況采用③法進(jìn)行回收率試驗，結(jié)果見附表3。由附表4可見，采用③法，所有供試品的金黃色葡萄球菌回收率均高于70%。

2.4 方法的驗證 采用③法進(jìn)行3次獨立的平行試驗。由附表5可見，3次平行試驗回收率均大于70%，表明該法能有效消除牛黃消炎片抑菌作用，可將牛黃消炎片細(xì)菌計數(shù)方法統(tǒng)一為離心沉淀集菌法-薄膜過濾法聯(lián)用。

3 結(jié)果與結(jié)論

微生物限度檢查方法：細(xì)菌計數(shù)采用離心沉淀集菌法-薄膜過濾法，霉菌和酵母菌計數(shù)及控制菌檢查均采用常規(guī)法。

4 討論

4.1 根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)提供的驗證資料，5號樣品采用離心沉淀集菌法-薄膜過濾法聯(lián)用。對于需要離心沉淀特殊處理的供試品，《中國藥典》2005年版規(guī)定應(yīng)增加稀釋劑對照組，且在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率均應(yīng)不低于70%。在試驗中，稀釋劑對照組按上述方法處理后，其菌回收率存在較大偏差，離心處理對細(xì)菌回收影響較大，尤其是金黃色葡萄球菌。有文獻(xiàn)報道，細(xì)菌菌體本身易吸附于大于20μm的微粒上，因此，《中國藥典》2010年版明確規(guī)定，離心沉淀集菌法僅適用于微生物限度檢查供試液的制備，并且應(yīng)盡量避免使用，且不可使用快速離心。為此將兩次離心修改為一次離心：500RPM離心，不超過3分鐘。由試驗可知，按500RPM離心5min后取上清液棄沉淀的處理方式會把吸附于供試品中的細(xì)菌、霉菌和酵母菌隨沉淀一同棄去，導(dǎo)致回收率達(dá)不到要求，從而離心沉淀集菌法是一種需改進(jìn)的方法。

附表1 樣品信息

附表2 常規(guī)法預(yù)試驗結(jié)果

附表3 枯草芽孢桿菌按②法回收率試驗結(jié)果

附表4 枯草芽孢桿菌按③法回收率試驗結(jié)果

附表5 3次平行驗證試驗結(jié)果

4.2 全國已有生產(chǎn)批準(zhǔn)文號的牛黃消炎片58個。由于地域原因，本研究只能采集到7個生產(chǎn)廠家的樣品進(jìn)行試驗，但本次試驗樣品的驗證資料中囊括了常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法和薄膜過濾法，使實驗結(jié)果具有了代表性。

4.3 目前《中國藥典》2010年版已對若干個品種的微生物限度檢查方法做出統(tǒng)一規(guī)定，足以表明以品種建立微生物限度檢查方法已經(jīng)受到重視。本研究對牛黃消炎片的微生物限度檢查方法進(jìn)行了探討性試驗，為新版藥典的修訂提供了數(shù)據(jù)支持。