阿米洛利對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞膜G蛋白的影響

廣東省東莞市常平醫(yī)院（523573）陳欣和

心肌肥厚是心血管系統(tǒng)常見的并發(fā)癥[1]，研究心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及藥物逆轉(zhuǎn)心肌肥厚尤為重要。近年研究表明，心肌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。有報(bào)道G蛋白的功能異常與高血壓、心肌肥厚等疾病的發(fā)生有關(guān)[2]，而G蛋白亞型在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的作用卻報(bào)道不一[3]；阿米洛利（Amiloride， Ami）是Na+/H+交換體（Na+-H+exchanger，NHE）抑制劑，能使SHR及LVH大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度有一定程度的下降[4][5]，但其對(duì)于壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，尤其是對(duì)G蛋白亞型表達(dá)的影響，未見有報(bào)道。本研究運(yùn)用Westernblot技術(shù)，觀察LVH大鼠及Ami給藥后心肌細(xì)胞膜上Gi及GS的α亞基含量的變化，探討壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞信號(hào)異常的機(jī)制及Ami 對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 Amiloride，MEM培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品，兔抗Giα購自Santaz公司，Ⅱ型膠原酶，辣根過氧化物酶標(biāo)記綿羊抗兔IgG購自上海華美生物制品有限公司，硝纖膜為浙江黃巖四青生化儀器廠產(chǎn)品，電泳儀為Bio-Rad公司的Power/PA200型，其他試劑為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠，重約200g，購自中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；共分4組，每組6只：對(duì)照組（大鼠行假手術(shù)后，第二周起po同體積的蒸餾水，連續(xù)4周）；LVH組（大鼠術(shù)后第二周起，po同體積的蒸餾水，連續(xù)4周）；Ami組（大鼠術(shù)后第二周起，po Ami 5mg·kg-1·d-1，連續(xù)4周）。

1.3 大鼠心肌肥厚模型的建立 取雄性SD大鼠，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（30mg/kg），行腹正中切口，分離腎動(dòng)脈上方的腹主動(dòng)脈約1cm長，用7號(hào)針頭緊貼腹主動(dòng)脈平行放置，將兩者一并結(jié)扎后抽出針頭，即可使腹主動(dòng)脈部分狹窄。假手術(shù)組分開腹主動(dòng)脈，結(jié)扎后立即松開。術(shù)后給予青霉素5萬U／只，連續(xù)一周預(yù)防感染。所有大鼠均飼以常規(guī)固體飼料及瓶裝飲用水，術(shù)后約3～5天，大鼠心肌即開始肥厚，2～3周達(dá)穩(wěn)定。

1.4 心肌細(xì)胞分離 大鼠斷頭處死，迅速取出心臟，置于無鈣冰MEM緩沖液（懸浮培養(yǎng)用的Joklik改良MEM培養(yǎng)基）中，清洗殘血。按Langendorff 法用含鈣MEM（nmol·L-1：MEM+NaHCO310，HEPES 10，CaCl21.25）進(jìn)行心臟灌流，灌流液中持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣體，灌流液溫度為36±0.5℃，灌流量為8ml·min-1。5min后改為無鈣含酶液（MEM+膠原酶Ⅱ型1mg·ml-1和0.1%小牛血清白蛋白），循環(huán)灌流30～40min至心肌松軟，色澤變白，然后取下心臟，棄去心房及血管組織，將右心室沿室間隔剪開，左右心室肌組織分別置于原含酶灌流液中，于37℃水浴中溫育，輕搖20min，用吸管吹打數(shù)次，使組織分散。然后用無鈣緩沖液清洗，單層紗布過濾，利用重力作用將死細(xì)胞與活細(xì)胞分離。細(xì)胞懸液鏡下70%～80%的細(xì)胞為桿狀，無或微弱低頻收縮，且不被臺(tái)盼藍(lán)染色。之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)鈣，復(fù)鈣過程應(yīng)緩慢，約需30min，以防細(xì)胞受損。

1.5 Westernblot技術(shù)測定心肌細(xì)胞G蛋白含量 心肌細(xì)胞膜蛋白用SDS-PAGE2X上樣液1∶1稀釋后，在水浴中煮沸5min。制備3%濃縮膠（H2O1.8ml，30%AA300μl，p H 6.8 T r i s 7 5 0 μ l，1 0%S D S 3 0 l，10%APS50μl，TEMED5μl）和10%分離膠（H2O1.6ml，30%AA2.0ml，p H 8.8 T r i s 1.3 m l，1 0%S D S 5 0 μ l，10%APS50μl，TEMED5μl）,加樣量為10μl，Marker4μl，在Bio-Rad公司的Power／PAC200型電泳儀上電泳45min，電泳條件：電壓180V，在300mA的條件下將之轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，1h后取下并立即將硝纖膜浸入5%脫脂奶粉中，室溫封閉60min。以PBS-T（PBS中含0.05%Tween20）溶液洗3次，每次5min，將硝纖膜浸于兔抗Gsα或Giα中（用PBS-0.3%BSA1:600稀釋），于4℃反應(yīng)過夜。次日將膜以PBS-T洗3次，每次5min，與1：100的綿羊抗兔IgG辣根過氧化物（HRP）結(jié)合物于37℃反應(yīng)75min，再以PBS-T洗膜4次，每次15min，加入新配底物液（6mg 4-氯-1-萘酚，2ml甲醇，10mlTBS，12μlH2O2），37℃顯色30min，用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。用GEL-Doc1000型（美國）凝膠成像分析系統(tǒng)獲取圖像，以Marker為標(biāo)準(zhǔn)，MA-Analysis軟件處理，得各條帶的相對(duì)密度值。

2 結(jié)果

LVH組大鼠心肌細(xì)胞膜上Giα、GSα蛋白含量較假手術(shù)對(duì)照組平均下降了16.5%和22.8%，而Ami組Giα含量與LVH組及對(duì)照組間均無差異；Ami組Gsα含量較LVH組分別平均增長了13.2%和33.9%（P＜0.01），但與假手術(shù)組間仍有差異。見附表。

附表 Ami對(duì)LVH大鼠心肌細(xì)胞膜上Giα及Gsα的亞基含量的變化（χ±s，n=6）

3 討論

心肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常與LVH的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[2]，一直是研究心肌肥厚的重點(diǎn)。近年來提出的G蛋白-Ca2+途徑被認(rèn)為與高血壓、LVH等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。關(guān)于心肌功能障礙時(shí)Giα的表達(dá)情況報(bào)道不一， 有報(bào)道稱在高血壓肥大的心肌中Gi含量增加[7]，也有研究表明DOCA大鼠主動(dòng)脈Giα含量降低[8]。

本研究中， Westernblot測定結(jié)果顯示在LVH大鼠心肌細(xì)胞膜上Giα含量下降，而Gi蛋白能抑制電壓依賴性鈣通道[9]，因此，Gi的表達(dá)降低會(huì)使得心肌細(xì)胞抑制電壓依賴性鈣通道的能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。心血管系統(tǒng)中與Gs結(jié)合的受體主要有β1，β2，VIP，5-HT等。配體與受體結(jié)合后，能通過Gs蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，使得cAMP生成增加，激活PKA，催化蛋白質(zhì)的磷酸化而誘導(dǎo)細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞的生長增殖。陸方林[10]等用氟化鈉和異丙腎上腺素分別刺激 Gs蛋白和β-AR，觀察到cAMP的生成能力均顯著降低，認(rèn)為心功能障礙時(shí)，β-AR-Gs蛋白復(fù)合體功能下降。本研究中，LVH大鼠心肌細(xì)胞膜的GSα含量較假手術(shù)對(duì)照組顯著降低。因此，LVH大鼠心功能障礙與G蛋白表達(dá)異常密切相關(guān)。

Ami作為一種NHE抑制劑可以通過抑制Na+／H+交換，間接抑制Na+／Ca2+交換，并可直接阻斷L-型Ca2+通道，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載[5][6]。本研究觀察到，Ami給藥后僅能輕度增加LVH大鼠心肌細(xì)胞膜上的Giα含量，但能使LVH大鼠GSα含量升高，并具有顯著性差異。因此，可以認(rèn)為，Ami治療心肌肥厚的機(jī)制可能與Gi蛋白的調(diào)控關(guān)系不大，而主要是通過提高Gs的功能激活A(yù)C，升高cAMP，從而發(fā)揮其保護(hù)作用。G蛋白是否并如何參與NHE的表達(dá)及活性的調(diào)控，及G蛋白中β、γ亞基在心肌肥厚發(fā)展中的作用是今后研究所面臨的新問題。研究心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尤其是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究，對(duì)于探討保護(hù)藥作用有著重要意義。