油菜蜂蜜中揮發性成分指紋圖譜的建立

涂 世，徐麗嫚，陳 靜，劉 睿*

(華中農業大學食品科學技術學院，武漢市蜂產品質量控制工程技術研究中心，湖北 武漢 430070)

油菜蜂蜜中揮發性成分指紋圖譜的建立

涂 世，徐麗嫚，陳 靜，劉 睿*

(華中農業大學食品科學技術學院，武漢市蜂產品質量控制工程技術研究中心，湖北 武漢 430070)

分析油菜單花蜜中的揮發性成分，建立油菜單花蜜揮發性成分的指紋圖譜。采用超聲波輔助萃取法提取49種不同產地的油菜單花蜜中的揮發性物質，并利用氣相-氫火焰化離子檢測(gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID)和氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技術分析，對氣相分析結果進行聚類分析和相似度分析。結果表明：49種油菜蜜分為5類，能明顯區分未經加工的原料油菜蜜和市售油菜蜜；原料油菜蜜和市售油菜蜜的揮發性成分存在明顯差異；推斷苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼可能作為油菜蜜植物源標記物。

油菜蜜；超聲波輔助萃取；氣相色譜-質譜法；指紋圖譜

我國是蜂蜜出口第一大國，但是由于摻假造假等問題頻發，嚴重影響我國蜂蜜在國際上的聲譽，導致我國蜂蜜交易價值相對較低。目前國內市場蜂蜜質量也是良莠不齊，摻假造假現象嚴重挫傷了消費者的購買積極性，致使國內消費市場增長緩慢。歐盟2001/110/EC關于蜂蜜的指令鼓勵蜂蜜按照植物源和地理源對蜂蜜進行標注以保障產品質量[1]。阿根廷蜂業協會利用國際物品編碼協會的全球統一標識系統進行蜂產品質量安全追溯，蜂產品產量居世界第二的阿根廷在產值上卻是世界第一，與其嚴格控制蜂蜜質量安全有著密切的關系[2]。我國鼓勵全面開展蜂產品質量可溯源技術體系的研究，需要對單花蜜的植物源和地理源進行標記，建立一套可信的檢測系統[3]。單花蜜具有天然的特性和功效，在市場上受消費者歡迎，可以增加其商業價值。例如，橙花蜜和洋槐蜜在世界范圍內的銷售價格比百花蜜高[4]。歐美等國家已經開展了一些單花蜜的揮發性指紋圖譜研究[5-11]，我國蜜源眾多、地域廣泛，開展單花蜜揮發性物質指紋圖譜研究尚在起步階段。

蜂蜜的特性、風味、顏色主要取決于花的類型或地理位置。每種單花蜜都會有自己特定的揮發性物質的指紋圖譜。蜂蜜中揮發性物質眾多，目前已經鑒定出來的有400多種[12]。關于蜂蜜揮發性物質在歐美等地區已有多年研究，國外學者初步確定了歐洲產栗樹、桉樹、石楠花、酸橙、百里香等植物的標記性物質[5,9,13-16]。李成斌等[17]對8種蜂蜜揮發性成分進行研究，找出了它們的共有成分。孫麗陽[18]采用固相微萃取及同時蒸餾萃取法對蜂蜜的揮發性成分進行提取，采用GC-MS方法進行分離、鑒定了蜂蜜中37種揮發性物質。目前用于分析蜂蜜揮發性成分的方法很多，其中超聲波輔助萃取(ultrasonic solvent extraction，USE)具有萃取效率高、萃取時間短、重現性好、適于熱敏性物質等優點[19-20]，國外一些研究[21-25]也證明USE方法萃取蜂蜜揮發性物質效果好。蜂蜜蜜源的典型分析方法，如花粉分析、感官分析，并不能有效對蜂蜜的來源進行歸類，而且，花粉和感官分析需要訓練有素的人員，并且比較耗時，主觀性強[4]。油菜蜜是我國產量最大的單花蜜，也是出口量最大的單花蜜，為探索和建立檢測蜂蜜植物源和地理源的方法，本實驗旨在通過分析油菜單花蜜的揮發性成分，建立單花蜜的揮發性物質指紋圖譜，期望為蜂蜜質量控制和蜂蜜產品全程跟蹤和快速溯源提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表1 油菜蜂蜜樣品產地及時間Table 1 Geographical origins and harvest time of rape honey samples

蜂蜜樣品：其產地和采集時間見表1。1～43、45～48號原料油菜蜜根據質量溯源管理體系從峰農購得，未經任何加工；44號原料油菜蜜直接從蜂農購得；49號原料油菜蜜從超市購得，原料儲存在－18℃的冰柜中。

無水乙醚(分析純)；正戊烷(分析純)；無水硫酸鎂(分析純)；油酸乙酯(純度98%)。

1.2 儀器與設備

6890N/5975B-GC/MSD氣質聯用儀、6890N氣相色譜儀 美國Agilent公司；KQ-100DE型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助萃取提取油菜蜂蜜揮發性成分方法

本研究參考Alissandrakis等[20]的研究方法，對影響超聲波輔助萃取的蜂蜜質量、溶劑體積、萃取時間和加水體積4個主要因素進行優化。固定溶劑體積30mL、萃取時間30min、加水體積20mL，蜂蜜質量選取20、30、40、50、60g五個梯度；固定蜂蜜質量40g，萃取時間30min、加水體積20mL，溶劑體積選取10、20、30、40、50mL五個梯度；固定蜂蜜質量40g、溶劑體積30mL、加水體積20mL，萃取時間選取10、20、30、40、50min五個梯度；固定蜂蜜質量40g、溶劑體積30mL、萃取時間30min，加水體積選取10、20、30、40、50mL五個梯度。通過對比以上不同單因素條件下GC分析的總峰面積和總峰個數，得到USE的最優條件為蜂蜜質量30g、溶劑體積30mL、超聲時間30mlL、加水體積40mL。

250mL碘量瓶中加入30g油菜蜂蜜、40mL純凈水、1.5g無水硫酸鎂、30mL溶劑正戊烷:無水乙醚1:2(V/V)，超聲頻率40kHz、水溫(25±3)℃、超聲萃取30min。有機層用分液漏斗分離，水層回加至碘量瓶，碘量瓶中加入一組相同溶劑30mL、萃取30min。共進行3次同樣的超聲萃取。混合有機層，加入2g無水硫酸鎂干燥，上層澄清有機層用0.45μm有機相過濾器過濾，揮干至1mL，用1.5mL安捷倫小進樣瓶密封，－18℃冷凍保存，待分析。

1.3.2 對照品溶液制備

準確量取0.1mL油酸乙酯，置100mL容量瓶中，用溶劑正戊烷:無水乙醚1:2(V/V)稀釋至刻度，搖勻備用。

1.3.3 氣相色譜條件

HP-5毛細管柱(30m×320μm，0.25μm)；進樣口溫度250℃，不分流進樣；FID檢測器溫度300℃，載氣高純氮氣，流速1.2mL/min；初始溫度36℃，保持5min，以4℃/min上升至180℃保持2min，以5℃/min上升至220℃保持2min，以10℃/min上升至260℃，保持5min。

1.3.4 氣相色譜質譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管柱(30m×250μm，0.25μm)；進樣口溫度250℃，不分流進樣；載氣為氦氣，流速1.2mL/min；程序升溫同1.3.3節。

質譜條件：溶劑延遲5min；接口溫度280℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；離子化方式：EI；電子能量70eV；質量范圍35～350u/s。

1.3.5 方法學考察

精密度實驗：取同一供試蜂蜜樣品，相同GC條件，連續進樣6次，測得各共有峰相對峰面積RSD小于2.52%，各共有峰相對保留時間RSD小于0.24%，表明儀器精密度良好。

重復性實驗：取同一蜂蜜樣品，按照1.3.1節方法平行制備6份供試樣品溶液，相同GC條件分析，測得各共有峰相對峰面積RSD小于4.56%，各共有峰相對保留時間RSD小于0.17%，表明實驗方法重復性良好。

穩定性實驗：取同一供試樣品，分別于0、2、4、8、12、24h進樣，相同GC條件分析，測得各共有峰相對峰面積RSD小于2.83%，各共有峰相對保留時間RSD小于0.08%，表明供試樣品在24h內穩定，達到指紋圖譜分析要求。

1.3.6 結果分析與數據處理

GC-MS分析結果運用計算機譜庫(NIST/WILEY)進行檢索分析，部分物質與標準品進行比較，確認揮發性化合物的化學成分。化合物相對含量確定采用面積歸一法。49種樣品的GC分析結果，根據相對保留時間和峰面積選取共有峰，采用SPSS 17.0軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 油菜蜂蜜GC指紋圖的建立

圖1 42號油菜蜜樣品的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of No.42 rape honey

49個蜂蜜樣品利用GC分析，通過比較49批樣品的色譜圖和相對保留時間，發現17個峰為大多數樣品共有，保留時間相對穩定，因此確定這17個峰為共有指紋峰[26]。國家藥品監督管理局(2000)在《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》中指出[27]：指紋圖譜的建立必須設立參照峰，應選擇指紋圖譜中峰面積較大，相對穩定的色譜峰作為參照峰。對比得到保留時間為48.305min的12號峰符合此條件，選為參照峰。通過GC-MS分析以及樣品溶液和對照品溶液GC保留時間的比對[28]，確定12號峰為油酸乙酯。典型樣品氣相色譜圖見圖1。

2.2 聚類分析結果

以參照色譜峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。利用SPSS軟件，采用組間聯接聚類法，計算準則為平方歐氏距離，對49個樣品進行聚類分析，成功將樣品分為5大類，結果見表2和圖2。

表2 聚類分析結果Table 2 Results of cluster analysis

圖2 油菜蜜聚類分析結果Fig.2 GC chromatogram of rape honey sample

根據聚類分析結果可以看出，49種油菜蜂蜜樣品被分為5類，G103湖北浠水和G048湖北仙桃樣品分為一類，產于2010年6月的青海樣品分為一類，產于2010年4月的荊州樣品分為一類， 市售江蘇揚州樣品分為一類，其余樣品分為一大類。從表2可以看出，49種蜂蜜樣品中有44種集中于第1類，達到了總數的89.8%，說明單花蜜可以通過揮發性物質達到歸類辨別的目的。其中5、28、40、44號樣品差異于第1類，可能與蜜源地的氣候、采集時間、采集過程、盛裝容器等因素相關。49號市售蜂蜜明顯不同于其他蜂蜜，初步推斷其為假蜂蜜。為詳細分析油菜蜂蜜中的揮發性物質和鑒別市售蜂蜜，進一步對樣品采用GC-MS分析。

2.3 相似度分析

參考聚類分析結果，選取第1類樣品采用平均矢量法建立共有模式[28-29]，得到標準指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積，結果見表3。

表3 標準指紋圖譜信息Table 3 Standard fingerprint data

以標準指紋圖譜為對照，計算各樣品的相關系數，聚類分析第1類樣品中相關系數大于0.90的樣品有30個，占總樣品數的61.22%，大于0.8的樣品有36個，占總樣品數的73.47%，其他4類樣品的匹配度均小于0.42，其中49號樣品匹配度為0.11。結果表明，相似度分析結果與聚類分析結果一致。

2.4 GC-MS鑒定

表4 GC-MS鑒定結果Table 4 GC-MS identification results

續表4

續表4

通過GC分析、SPSS聚類分析和相似度分析情況，選取5、34、40、42號油菜蜜和49號市售油菜蜜的GCMS結果進行對比分析。

從表4可以看出，49號市售油菜蜜和原料油菜蜜存在明顯差異，49號樣品總離子流圖的總峰少、峰值都很低，揮發性物質較少，該分析結果與氣相色譜的分類結果一致，初步推斷該市售蜜為摻假或造假蜜。分析其他4種樣品可以看出，5號樣品主要含有油酸乙酯(20.026%)、二十五烷(11.207%)、2,6,10,14-四甲基-十六烷(7.179%)、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼(6.775%)，34號樣品主要含有油酸乙酯(18.980%)、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼(9.529%)、苯甲酸(7.240%)、棕櫚酸乙酯(3.704%)，40號樣品主要含有二十七烷(21.317%)、二十五烷(7.582%)、油酸乙酯(3.882%)、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼(2.784%)，42號樣品主要含有二十五烷(9.843%)、油酸乙酯(4.312%)、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼(3.962%)、仲丁基醚(2.789%)。5號油菜蜜含有較多的2,6,10,14-四甲基-十六烷(7.179%)，40號油菜蜜中二十七烷(21.317%)含量最多，這也可能是這兩種油菜蜜差異于第1大類油菜蜜的主要原因，也證明了GC和GC-MS分析結果的一致性。以上4種油菜蜜存在一些含量較高的共有組分：油酸乙酯、苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼、棕櫚酸乙酯、順-9-二十三碳烯、二十五烷、二十七烷，這也證明蜜源是決定蜂蜜揮發性物質組成的主要因素之一[30]。苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼在4種油菜蜜中含量較高，綜合其他一些原料蜜的分析結果可以得出，苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼含量在1.18%～16.37%之間，并且該物質在市售油菜蜜中沒有被檢出，因此其可能為油菜蜜的植物源標記物之一。Radovic等[11]報道過二甲基二硫和二甲基丙醇可以作為歐洲地區油菜蜜的植物源標記物。Kakonienè等[12]研究發現油菜蜜中普遍都含有一定量的苯乙醛，本研究發現34、42號兩種油菜蜜中含有苯乙醛。本研究結果與他們的結果不同可能在于地理源不同和萃取方法的差異，這也說明了地理源對蜂蜜揮發性物質影響的重要性。4種樣品中含有許多烴類物質，可能主要與采取超聲波輔助萃取的方法有關，Jerkovi等[23]指出USE方法提取的主要物質是揮發性和低分子質量的半揮發性物質。

3 結 論

本研究利用GC和GC-MS分析了超聲波輔助萃取的49種油菜蜜中的揮發性物質，成功將49種油菜蜜分為5大類，并且第1大類占87.76%；市售油菜蜜與其他油菜蜜樣品相比其揮發性成分明顯不同，自成一類，結合GC-MS分析結果，可以推斷市售油菜蜜可能為摻假或造假蜜。進一步發現苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼可能作為油菜蜜植物源標記物，這還需要對比不同植物源蜂蜜進行確證。本研究與歐洲發現的油菜蜜標記物有所不同，但是沒有發現國內不同地區油菜蜜地域之間的明顯差異。

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Fingerprinting of Volatile Composition of Rape Honey

TU Shi，XU Li-man，CHEN Jing，LIU Rui* (Wuhan Research Center on Quality Control Engineering of Bee Products, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In order to label the botanical and geographical origin of unioral rape honey and discriminate adulterated rape honey, the volatile components in 49 rape honey samples from different geographical origins were analyzed by ultrasonic-assisted extraction, gas chromatography with flame ionization detector (GC-FID) and gas chromatography-mass spectrometry (GCMS) and fingerprinted. The results indicated that 49 samples investigated could be assigned into 5 groups, with an effective discrimination between raw and commercial rape honeys. Both rape honeys exhibited an obvious difference in their volatile components. We deduce that benzoic acid-4-hydroxy-3,5-dimethoxy-hydrazide has the potential to be used as a marker of botanical origin of rape honey.

rape honey；ultrasonic-assisted solvent extraction (USE)；gas chromatography-mass spectrometry (GCMS)；fingerprint

S896.1

A

1002-6630(2011)20-0136-06

2011-06-29

中央高校基本科研業務費專項(2010PY015)；武漢市蜂產品質量控制工程技術研究中心項目(200920137007)

涂世(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為蜂產品加工及質量控制。E-mail：ts88532@126.com

*通信作者：劉睿(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為蜂產品加工及質量控制。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn