高糖環境下HGF對腎小球系膜細胞增殖及TGF-β1 的影響

王保忠

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發癥之一，腎小球系膜細胞(MsC)功能的研究對闡明DN發病機制具有重要意義。近年研究表明轉化生長因子(TGF-β1)在DN發病機制中起重要作用。肝細胞生長因子(HGF)能有效抑制與慢性腎臟疾病及慢性腎功能衰竭密切相關的腎間質纖維化的進展過程。本研究以大鼠腎小球系膜細胞(RMC)為靶細胞，用高糖誘導造成體外培養的RMC功能紊亂，觀察RMC的增殖情況、TGF-β1的分泌變化以及 HGF干預作用，以闡明HGF對糖尿患者腎臟可能具有的保護作用，為DN的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 大鼠腎小球系膜細胞(RMC)的培養與處理 RMC常規復蘇后移入細胞培養瓶中靜置培養。培養2～3 d，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞傳代。RMC由中國醫學科學院基礎醫學研究所提供。

1.2 MTT法測細胞增殖 將RMC接種于96孔板，按以下分組給藥:①正常對照組(用DMEM培養液培養細胞，葡萄糖終濃度5.5 mmol/L)，②高糖組(DMEM培養液中加入D-葡萄糖，葡萄糖終濃度25.0 mmol/L)，③高糖+HGF組(25.0 mmol/L葡萄糖，50 ng/ml HGF)，加入相應培養液培養不同時間(12，24，48，96 h)，每組設6個復孔。反應結束后每孔加入25 μlMTT(5 mg/ml)溶液，繼續孵育4 h，棄上清，每孔加入100 μl二甲基亞楓(DMSO)，振蕩30 min后于酶標儀490 nm處測光吸收(OD)值。OD值越大，表明細胞增殖越旺盛。

1.3 酶聯免疫吸附技術測細胞上清液中TGF-β1水平 (1)TGF-β1分泌檢測分組:將RMC接種于96孔培養板中，分為3組:①正常對照組(葡萄糖濃度5.5mmol/L);②高糖組(葡萄糖濃度25.0mmol/L)，甘露醇對照組 (20.0mmol/L甘露醇，使其滲透壓與高糖組相同)。分別于培養的12、24、48、96 h收集細胞，用雙抗體夾心法(ABC-ELISA)檢測TGF-β1分泌量。每組均設6個復孔。另外將RMC分為:①正常對照組(葡萄糖濃度5.5mmol/L)，②高糖組(葡萄糖濃度25.0mmol/L)③高糖+HGF組(葡萄糖濃度25.0mmol/L，HGF濃度分別為25、50、100、200ng/ml)。分別培養48 h后，用雙抗體夾心法(ABC-ELISA)測定此時TGF-β1分泌情況。每組實驗設6個復孔。(2)按照TGF-β1/ELISA試劑盒(由上海生物工程公司提供)說明書進行操作，最終于酶標儀450nm處測(OD)值。大鼠TGF-β1的濃度與OD值成正比。根據TGF-β1標準品A值曲線y=ymax×x^n/(k^n+x^n)，換算所測上清液中TGF-β1的含量。

2 結果

2.1 高糖和HGF對大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響 12 h時間點各組間細胞增殖均無顯著性差異。24 h時間點，高糖組較正常對照組相比促進細胞增殖(P＜0.05)，高糖+HGF組較高糖組相比，可以抑制細胞增殖(P＜0.05)。48，72和96 h時間點，高糖組較正常對照組相比細胞增殖受抑(P＜0.05)。高糖+HGF組較高糖組相比促進細胞增殖(P＜0.05)。而且呈時間依賴性，(見表1)。

2.2 高糖對大鼠腎小球系膜細胞TGF-β1分泌的結果 高糖組TGF-β1分泌量從24 h開始升高，持續至96 h達到高峰。甘露醇組同樣出現TGF-β1分泌，作用24 h后同對照組相比存在差異(P＜0.05)。但同高糖組相比，甘露醇組的表達量又遠遠低于高糖組(P＜0.05)。在96 h，甘露醇組與對照組相比沒有差異(P＞0.05)。說明甘露醇組并沒有促進TGF-β1分泌，(見表2)。

2.3 高糖和HGF對大鼠腎小球系膜細胞TGF-β1分泌的結果 高糖組中TGF-β1分泌量較高，HGF組與高糖組相比，TGF-β1分泌量明顯下降，有統計學差異(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，(見表3)。

表1 高糖與HGF作用下腎小球系膜細胞的增殖(OD值)(n=6)

表2 高糖作用下腎小球系膜細胞TGF-β1的分泌量(n=6 ng/ml)

表3 高糖TG與F-βHGF作用下腎小球系膜細胞1的分泌量(n=6)

3 討論

DN是糖尿病患者常見的微血管并發癥之一，其主要的病理變化為腎小球肥大，ECM產生增多。MsC是腎小球內產生ECM的主要固有細胞，在DN發病過程中不僅是被動受害者，而且也是直接參與者，通過其自身代謝和功能改變直接影響DN進程。細胞因子在DN的發病中起著重要的作用。TGF-β1是唯一對ECM形成具有廣泛調節作用的細胞因子。HGF主要由間質細胞產生。腎臟是HGF表達最高的臟器。HGF能夠調節細胞的多種功能如細胞的生存，增殖，遷移以及分化。

有研究證實，采用抗TGF-β1抗體抑制TGF-β1的合成可以緩解腎臟纖維化的程度［1］。進一步說明TGF-β1在腎臟纖維化中的重要性。本實驗也同樣證實，高糖誘導腎小球系膜細胞分泌TGF-β1，于高糖作24 h開始合成增加，并且隨著高糖持續作用，TGF-β1呈現持續性高表達。同時我們對滲透壓因素進行測定，結果證實，高糖誘導細胞的改變可能部分是由于滲透壓因素所致，然而高糖誘導細胞表達TGF-β1，并不完全依賴滲透壓介導。說明高糖本身就可以誘導細胞發生損傷。因此，本研究在體外培養腎小球系膜細胞，將高糖作為一個重要因素進行誘導刺激，部分模擬了體內糖尿病環境。

近年來研究表明，減少ECM的積聚，拮抗細胞因子的不良作用，抑制MsC的增殖活化已成為防治腎小球硬化、延緩腎小球疾病進展中的重要環節［2］。在正常組織中，TGF-β1和HGF處于一種互逆平衡狀態。在病理狀態下，若HGF占優勢則利于損傷修復;若TGF-β1占優勢則組織出現纖維化改變［3］。Cruzado等［4］發現HGF基因治療降低了進展期 DN的蛋白尿，緩解了系膜增多和腎小球硬化。與其能遏止系膜區 TGF-β1和結締組織因(connective tissue growth factor，CTGF)的表達上調有關。我們研究發現，高糖誘導早期，細胞并沒有發生TGF-β1高表達。高糖作用晚期，TGF-β1表達開始增加。加入HGF可以降低TGF-β1的分泌。局部HGF水平降低以及TGF-β1表達升高，可能共同參與了腎臟纖維化過程［5，6］。本研究證實 HGF可以直接抑制 TGF-β1的分泌，并且存在劑量依賴性抑制作用，隨著HGF劑量的增加，其抑制TGF-β1表達的作用也更顯著。另外，有其他相關研究證實，HGF還可以通過抑制纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)表達［7］使ECM合成減少，來預防ECM沉積。從上述結果可以看出HGF和TGF-β1生物活性是相反的。

綜上所述，高糖刺激腎小球系膜細胞TGF-β1出現穩定高表達，而給予外源性的HGF后，系膜細胞TGF-β1的分泌減少，而且呈時間依賴性。我們將在以后的研究中進一步闡明HGF在介導DN發病中的具體機制，為DN防治提供新途徑。

［1］ Isaka Y，Tsujie M，Ando Y，et al.Transforming growth factor-1 antisense oligonucleotides block interstitial fibrosis in unilateral obstruction.Kidney Int，2000，58:1885.

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［3］ Liu Y.Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis:therapeutic potential and mechanisms of action.Am Physiol Renal Physiol，2004，287:7-16.

［4］ Cruzado J，LloherasN，et al Retression of advanced diabetic nephropathy by hepatocyte growth factor gene therapy in rats.Diabetes，2004，53(4):1119-1127.

［5］ Mizuno S，Matsumoto K，Kurosawa T，et al.Reciprocal balance of hepatocyte growth factor and transforming growth factor-beta 1 in renal fibrosis in mice.Kidney Int，2000，57(3):937.

［6］ Liu YH，Rajur K，Tolbert E，et al.Endogenous hepatocyte growth factor ameliorates chronic renal injury by activation matrixdegradation pathways.Kidney Int，2000，58:20-28.

［7］ 牟姍，張慶怡，趙涵芳，等.高糖刺激人腎臟成纖維細胞HGF/c-met的表達及其意義.中華內分泌與代謝雜志，2002，18(4):260.