結球生菜多酚氧化酶動力學特性研究

饒先軍，劉 升，王則金，馮雙慶，顏麗萍

(1.福建農林大學食品科學學院，福建福州350002; 2.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京100097; 3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083)

結球生菜多酚氧化酶動力學特性研究

饒先軍1，劉 升2，*，王則金1，馮雙慶3，顏麗萍1

(1.福建農林大學食品科學學院，福建福州350002; 2.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京100097; 3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083)

為解決生菜加工貯藏過程中出現的褐變問題，研究了結球生菜多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)動力學特性，分析了pH、溫度及底物濃度等因素對PPO活性的影響，建立了結球生菜褐變的反應動力學方程。結果表明，結球生菜最適pH為8.0，最適溫度為40℃。用Michaelis-Menten機理描述可得結球生菜PPO相應的動力學參數Km= 0.0691mol/L，vmax=26.5957U/min。生菜葉片組織中的PPO活性較強，葉柄和莖部組織中的PPO活性差異不大，均低于葉片組織中的PPO活性，且結球生菜莖部切口處已經發生褐變的部分PPO活性為6.12U/min，遠高于沒有發生褐變的部分。

結球生菜，多酚氧化酶，褐變，動力學

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮結球生菜 2009年10月17日采收于北京市順義區，品種為射手101。

Thermo Fisher高速冷凍離心機，島津UV-1800紫外可見分光光度計，HANNA HI8418 pH計，Metteler PE360電子天平，北京長風HW.SY11-K數顯恒溫水浴鍋，Eppendorf移液器及一些常規的實驗設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 PPO粗酶液制備 取新鮮結球生菜切碎混勻，準確稱取2.0g置于研缽中，加入少量石英砂和4.0mL預冷過的50.0mmol/L pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)，冰浴研磨勻漿后轉移到50mL離心管中，用6mL上述的PBS沖洗研缽3次，離心(4℃，12000r/min，15min)，取上清液保存備用。

1.2.2 PPO活性測定 將 50.0mmol/L pH7.0PBS、0.1mol/L的鄰苯二酚溶液，于25℃下保溫10min后，取2.8mL上述保溫過的PBS和0.1mL鄰苯二酚溶液置于石英比色皿中，再迅速加入0.1mLPPO粗酶液，混勻后于398nm波長處測定反應體系吸光度A值，每5s記錄一次，共3min，測定重復3次。以每克樣品(鮮重)吸光度變化值增加1為1個活性單位U，酶活性可以表示為U/min。

1.2.3 pH實驗 分別取2.8mL不同pH的緩沖液(pH=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，加入0.1mL 0.1mol/L的鄰苯二酚溶液后，再迅速加入0.1mL粗酶液，混勻后在398nm波長條件下測定其吸光度變化值。

1.2.4 溫度實驗 取50mmol/L、1.2.3中測得最適pH的磷酸緩沖液，濃度為0.1mol/L鄰苯二酚溶液分別在0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100℃的環境中恒溫10min，取出后迅速加入0.1mL粗酶液，混勻后在398nm波長條件下測定其吸光度變化值。

1.2.5 底物濃度實驗 在2.4mL濃度為0.1 mol/L磷酸緩沖液(1.2.3中測得最適pH)中，分別加入濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mol/L的鄰苯二酚溶液0.4mL，然后再分別加入0.2mL PPO粗酶液，迅速搖勻，在398nm波長條件下測定其吸光度變化值，測得粗酶液的活性。

1.2.6 組織定位實驗 結球生菜分為葉、葉柄、莖三部分，按1.2.1方法制備粗酶液，其中磷酸緩沖液為pH8.0，并按1.2.2方法測定PPO活性。

2 結果與分析

2.1 pH對PPO活性的影響

在pH4.0～10.0范圍內進行酶活性測定，pH對PPO活性的影響如圖1所示。PPO的最適pH因酶和底物的不同而不同，當以C6H6O2為底物時，從圖1中可以看出，PPO活性的適宜pH偏堿性，最適pH為8.0左右。當低于或高于該值時，PPO活性呈明顯的下降趨勢，當pH升至10.0時，其活性只有最高活性的54.63%;當pH降至4.0附近時，其活性僅為最高活性的1.87%，pH越低，酶活性下降越快。PPO是一種含Cu蛋白質［3］，其作用機制是銅的氧化還原作用，在酸性環境條件下，PPO中的Cu被解離出來，使其活性降低，因而可以防止褐變的產生;在pH大于8的堿性環境條件下，Cu會解離成不溶性的Cu(OH)2，使其失活，減少褐變產生。因此在生菜加工貯藏過程中可以根據這一性質考慮采取一些相關措施，如使用食用酸(檸檬酸等)來降低pH，且對酚酶輔基銅離子有螯合作用，抑制酶的活性，也能明顯減少褐變發生［4］。

圖1 pH對PPO活性的影響

2.2 溫度對PPO活性的影響

將50mmol/L磷酸緩沖液、濃度為0.1mol/L鄰苯二酚溶液分別在0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100℃的環境中恒溫加熱10min，取出后迅速加入0.1mL粗酶液，混勻后測定其酶的活性。PPO是一種蛋白質，不適宜的溫度會破壞其活性部位三維結構的完整性，而這種結構又是保持酶活性的關鍵因素［5］。溫度對PPO活性有雙重影響，一是溫度升高加快酶催化反應速度，二是促使酶蛋白變性，這是兩種對抗反應的綜合反應。從圖2中可以看出，低溫能抑制PPO活性，當溫度在0～40℃條件下，PPO活性隨著溫度的上升而上升，至40℃時達到最高值;溫度高于40℃時，PPO活性開始下降，60℃時PPO活性只有最大活性的55.3%;當溫度升至80℃及以上時，PPO活性基本消失，僅為40℃條件下酶活性的15.53%。

圖2 溫度對PPO活性的影響

2.3 底物濃度對PPO活性的影響

以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mol/L的鄰苯二酚溶液為底物，研究了25℃、pH8.0條件下不同底物濃度的產物吸光度值隨時間的變化規律，擬合所得的直線斜率即為反應的初速率v。由于該實驗是在敞開的容器中進行，O2濃度較大且恒定，故可看成是單底物酶促反應，其機理為:

反應速率方程為

從圖3中可以看出，C6H6O2濃度［S］對反應初速率影響很大，且在濃度較小時，其變化對反應速率的影響呈直線上升趨勢，在濃度較大時，其變化對反應初速率影響較小，當達到一定值時趨于穩定，即vmax，此時再增加底物濃度也不能使反應速率加快，濃度太高反而使反應速率下降，這可能是PPO有效活性被結合后產生的抑制效果，符合上述Michaelis-Menten機理［6-7］。

圖3 底物濃度對PPO活性的影響

2.4 米氏常數Km及vmax

由此說明，生菜褐變反應動力學符合米氏方程。

根據直線斜率與截距，求得反映底物與酶結合的親和力米氏常數Km=0.0691mol/L，最大反應速率vmax=26.5957U/min。

圖4 結球生菜米氏方程

2.5 生菜不同部位PPO活性

以結球生菜葉、葉柄、莖的提取酶液分別與鄰苯二酚反應，測得的PPO活性，結果見圖5。

圖5 結球生菜不同部位PPO活性

從圖5可知，結球生菜的葉片組織中PPO活性較高，為11.22U/min，葉柄和莖部組織中的PPO活性分別為葉片的30.75%和22.55%，差異不大，且均低于葉片，但生菜采收后莖部受機械切割，在貯藏和運輸中其切口處很容易發生褐變。

2.6 生菜莖部切口處PPO活性

生菜在采收后，由于莖部切口處受到了機械損傷，在運輸、貯藏和銷售過程中切口處多酚類物質極易受多酚氧化酶氧化作用發生褐變而產生褐色物質，影響生菜的外觀品質和商品價值。

由表1可以看出，結球生菜莖部切口處已經發生褐變的部分PPO活性為6.12U/min，遠高于未發生褐變處的PPO活性，差異顯著。

表1 生菜莖部切口處PPO活性

3 結論

3.1 結球生菜PPO活性適宜pH偏堿性，當pH8.0時，其PPO活性最大，為11.22U/min，因此在加工貯藏過程中應控制pH，使其pH呈酸性，以減少其褐變的發生;PPO活性在40℃時最大，為12.94U/min，低溫有利于抑制酶的活性。

3.2 結球生菜褐變反應的動力學符合米氏方程所描述的單底物酶促反應動力學，其反應速率與底物的關系:

米氏常數Km=0.0691mol/L;最大反應速度vmax=26.5957U/min。

在實際生產中可以采取一些措施避開多酚氧化酶的最適反應條件，如采摘、運輸、加工貯藏過程中把生菜盡量控制在低溫的環境下，或適當調節(降低)pH。

3.3 結球生菜中的葉片PPO活性最強，葉柄和莖的PPO活性差異不大，但生菜采收后莖部受機械切割，在貯藏和運輸中其切口處很容易發生褐變;結球生菜莖部切口處已經發生褐變的部分 PPO活性為6.12U/min，遠高于沒有發生褐變的部分。

［1］農業部全國農業技術推廣總站.生菜花椰菜綠菜花生產160問［M］.北京:中國農業出版社，1998.

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Study on the kinetic character of polyphenol oxidase in iceberg lettuce

RAO Xian-jun1，LIU Sheng2，*，WANG Ze-jin1，FENG Shuang-qing3，YAN Li-ping1
(1.College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China;2.Beijing Vegetable Research Center Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China; 3.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China)

For solving the problem of browning in the process and storage of iceberg lettuce，the Kinetic Character of polyphenol oxidase(PPO)in iceberg lettuce were studied.Analysised the PPO activity in different pH，temperature and substrate concentration，established the kinetic equation of iceberg lettuce browning.The results showed that the optimum pH and temperature of lettuce PPO was 8.0 and 40℃，respectively.The reaction kinetic of enzymatic browning was accordant with michaelis equation，the Kmand vmaxwere 0.0691mol/L and 26.5957U/min，respectively.The PPO activity in iceberg lettuce leaf tissue was very strong，little difference of PPO activity in the organization of petiole and stems，but lower than in the leaf tissue.And the PPO activity was 6.12U/min in iceberg lettuce stems incision which had some browning，much higher than no browning part.

iceberg lettuce;polyphenol oxidase;browning;kinetic

TS255.1

A

1002-0306(2011)09-0080-03

生菜(Lactuca sativa L.)，又名葉用萵苣，包括皺葉生菜、直立生菜、結球生菜，為菊科萵苣屬一年或兩年生草本植物，含有豐富的營養物質［1］。生菜屬低糖、低脂肪蔬菜，富含水分，每100g食用部分含水分高達94%～96%，故生食清脆爽口，特別鮮嫩，每100g食用部分還含蛋白質1～1.4g、碳水化合物1.8～3.2g、維生素C10～15mg及一些礦物質，生菜還含有蘋果酸和琥珀酸等有機物質以及萵苣素、天冬堿、精油、甘露醇和酶、甲狀腺活動激素等活性物質［2］。生菜含有的萵苣素等苦味物質有鎮痛催眠作用，并對消化無力、酸度低、便秘、高血壓和心臟病均有治療作用。在日常生活中生菜常在切割后被單獨或同其它蔬菜包裝在一起，是一種即食或配合沙拉食用的綠葉蔬菜。但生菜在加工和貯藏過程由于其含有的多酚氧化酶(PPO)氧化酚類物質會形成醌類化合物，進一步聚合形成褐色或棕色的聚合物，從而導致生菜切口處變褐變紅，影響生菜的外觀品質、營養價值和商品價值。因此，研究生菜PPO動力學特性，進一步采取有效的措施，最大程度地減少其在加工貯藏過程中的褐變，為生菜商業化加工和貯藏保鮮提供理論依據和技術支持，從而提高農民和企業的經濟效益，帶動整個生菜產業的長遠發展。

2010-08-20 *通訊聯系人

饒先軍(1984-)，男，碩士研究生，主要從事食品加工及貯藏的研究。

國家863計劃課題(2008AA100803);國家“十一五”科技支撐項目(2009BADB9B09-6)。