毛豆腐提取物的自由基清除活性研究

杭 梅，趙新淮

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

毛豆腐提取物的自由基清除活性研究

杭 梅，趙新淮*

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

利用20%、40%、60%乙醇溶液(v/v)、pH4.5水、pH6.5水作為提取溶劑，對發酵時間為3、5、7、9d的毛豆腐分別進行提取，測定提取物中蛋白質的提取率、水解度，以及采用DPPH、ABTS法評價提取物的體外自由基清除活性。研究結果表明，隨著毛豆腐發酵時間的延長，提取物中蛋白質的提取率、水解度均逐漸增加，并且提取物的自由基清除活性也明顯地提高;通過比較還發現，毛豆腐乙醇提取物的自由基清除活性高于水提取物，且隨著乙醇濃度的提高，提取物的自由基清除活性提高。排阻色譜分析結果證明，發酵9d后毛豆腐中蛋白質充分水解，5種提取物的主要成分為肽與氨基酸。

毛豆腐，提取物，提取率，水解度，自由基清除活性，排阻色譜

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆腐 購自市場;毛霉 從自然發酵生產的豆制品中分離獲得;1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、2，2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS) 美國Sigma公司;其它所用試劑 為分析純試劑;所用水 蒸餾水。

UV-2401PC型紫外可見分光光度計 日本島津公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器中國有限公司;Kjeltec TM2300型自動凱氏定氮儀 瑞士Foss公司;DHP-9272型電熱恒溫培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器鎮海金鑫醫療器械有限公司;H-1型微型漩渦混合器、DS-1高速組織搗碎機 上海精科實業有限公司;YH-4BS型遠紅外恒溫干燥箱 天津市中環實驗電爐有限公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛豆腐的制作 a.取豆腐，將豆腐對半切塊，121℃滅菌30min后，稍風干除去水滴，然后擺放在竹制的蒸籠內，豆腐塊之間應保持一定距離，以利于發酵。b.取毛霉制成菌懸液，用毛刷將菌懸液均勻涂于各表面，再覆蓋好后放入培養箱。c.培養箱溫度控制在15～20℃之間。發酵過程中，豆腐表面出現白色絨毛;發酵后期豆腐軟化并有毛豆腐特有的香氣。

1.2.2 一些化學指標的測定

1.2.2.1 水分的測定 105℃烘干法［13］。

1.2.2.2 水溶性蛋白質含量的測定 凱氏定氮法［14］。分別將不同天數發酵好的毛豆腐在 121℃滅酶30min，取出冷卻，除去菌膜后用高速組織搗碎機搗碎。取一定量樣品進行凱氏定氮分析，計算總蛋白質含量，換算系數為5.71。然后，取75g樣品用蒸餾水定容到250mL，高速組織搗碎機中12000r/min搗碎1.5min，并在5000r/min離心15min，得到上清液進行凱氏定氮分析，計算水溶性蛋白質含量，換算系數為5.71。實驗平行3次。

1.2.3 毛豆腐提取物的制備及蛋白質提取率測定取75g毛豆腐分別與20%、40%、60%乙醇溶液(v/v)或pH4.5、pH6.5的水(1mol/L磷酸調節pH)混合并定容到250mL作為樣品，之后在高速組織搗碎機中 12000r/min搗碎 1.5min，5000r/min離心15min，分離上清液得到毛豆腐提取物。乙醇溶液提取物通過旋轉蒸發除去乙醇后，定容至原體積。各提取物和原始樣品分別進行凱氏定氮分析，確定蛋白質提取率。實驗平行3次。

蛋白質提取率(%)=［上清液中蛋白質含量(mg/mL)/總蛋白質含量(mg/mL)］×100%

1.2.4 蛋白質含量、游離氨基含量與蛋白質水解度的測定

1.2.4.1 蛋白質含量測定 參照凱氏定氮法［14］。

1.2.4.2 氨基含量與蛋白質水解度(DH)測定 參照OPA法［15-16］，水解度計算公式［17］如下:

式中:5.71為大豆蛋白質的換算系數;0.35mmol/g為大豆蛋白質的游離氨基含量;7.8mmol/g為大豆蛋白質的肽鍵含量;N1為提取物的氮含量(mg/mL)。

1.2.5 抗氧化活性分析

1.2.5.1 DPPH自由基的清除 文獻18并略作改動，樣品濃度均為0.5mg/mL。

1.2.5.2 ABTS自由基清除能力 文獻19并略作改動，樣品濃度均為4mg/mL。

1.2.6 排阻色譜分析 參照文獻20并略作修改，利用AKTA explorer蛋白質快速層析系統、Superdex-25 10/300 GL(10mm×300 mm)色譜柱分析，最大壓力設定為0.15MPa，磷酸鹽緩沖溶液(pH 12)為洗脫液，流速為0.5mL/min，檢測波長為215nm。開機后，分別用2個柱體積的超純水和洗脫液清洗色譜柱至電導率穩定。樣品蛋白質濃度為2mg/mL;樣品過0.22μm水膜后進樣量為0.5mL，并用緩沖液洗脫。

選用細胞色素 C、胰島素、氧化型谷胱甘肽、L-酪氨酸，作為測定提取物分子質量的標準物質。先用緩沖溶液單獨配制1mg/mL的標準溶液，在上述條件下分析;然后再用緩沖液將4種標準物質配制為1mg/mL的混合溶液，同樣在上述條件下處理、分析。

1.2.7 數據的統計分析 采用 Excel 2003軟件和SPSS 13.0軟件對數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中毛豆腐的重要組成變化

毛豆腐發酵過程中，水分會因蒸發而丟失，蛋白質等組成會發生變化，如表1所示。隨著毛豆腐發酵時間的延長，水分含量降低，總蛋白質含量逐漸增加，并且水溶性蛋白質有非常顯著的增加，說明毛霉分泌的蛋白酶具有蛋白質分解能力，隨著發酵時間的延長而不斷水解大豆蛋白質，導致產生分子量較小的肽與氨基酸，使得水提取物中的蛋白質含量顯著增加。

2.2 毛豆腐提取物中可溶性蛋白質的提取率

在不同的溶劑提取條件下，不同發酵時間的毛豆腐中可溶性蛋白質的提取率如表2所示。隨著發酵時間的延長，毛霉分泌蛋白酶的水解作用加大，蛋白質的水解增加，導致可溶性蛋白質的提取率增加。故此，不同提取溶劑下的可溶性蛋白質的提取率均呈現出增加的趨勢。

對發酵毛豆腐與未發酵毛豆腐分別采用5種溶劑進行提取，用pH 6.5水得到的可溶性蛋白質最多、提取率最高，而60%乙醇得到的可溶性蛋白質最少、提取率最低。3種乙醇提取物中，可溶性蛋白質的提取率隨乙醇濃度的增加而降低，這與提取溶劑的極性降低有關。由于pH4.5為大豆蛋白的等電點，蛋白質溶解度低，所以，pH4.5水的可溶性蛋白質提取率比pH6.5水的提取率更低。整體上看，第9d時，無論采用何種提取溶劑，可溶性蛋白質的提取率最大。

表1 不同發酵時間毛豆腐的一些化學指標變化

表2 不同發酵時間毛豆腐提取物中的蛋白質提取率(%)

表3 不同發酵時間毛豆腐提取物中的蛋白質水解度(%)

表4 不同發酵時間毛豆腐提取物的DPPH自由基清除活性(%)

表5 不同發酵時間毛豆腐提取物的ABTS自由基清除活性(%)

2.3 毛豆腐提取物中蛋白質的水解度

不同發酵時間，不同提取溶劑得到的毛豆腐提取物中，蛋白質的水解度測定結果如表3所示。由于所測得的蛋白質水解度數值范圍在17%～45%，證明所得到的提取物中蛋白質成分是大豆蛋白的水解物。數據表明，隨著毛豆腐發酵時間的延長，大豆蛋白的水解作用逐漸增加，所以產生更多的小肽和氨基酸，整體上提取物中蛋白質的水解度隨著發酵時間的延長而增大。pH4.5水提取毛豆腐時，由于大豆蛋白質沉淀，提取物中含有最多的小肽和氨基酸、最少的蛋白質，提取物的蛋白質水解度最大。pH6.5水不僅提取小肽和氨基酸，也提取部分蛋白質，所以提取物的蛋白質水解度最小。由于乙醇濃度越高，提取物中蛋白質含量越低而小肽和氨基酸越高，所以乙醇溶液提取物中蛋白質的水解度，整體上與乙醇濃度成正比，60%乙醇溶液提取物中蛋白質的水解度最大。

2.4 毛豆腐提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除活性

對發酵時間為3、5、7、9d的毛豆腐分別用5種提取溶劑進行提取，然后對提取物的自由基清除活性進行評價，并以大豆分離蛋白為對照進行比較，得到表4和表5的結果。我們選用大多數研究中常用的DPPH、ABTS自由基作為評價對象。

分析結果表明，大豆分離蛋白對DPPH自由基的清除率為 3.79%，對 ABTS自由基的清除率為4.97%。相比之下，隨著發酵時間延長，不同溶劑提取的毛豆腐提取物對DPPH、ABTS自由基的清除活性增強，并且遠遠高于大豆分離蛋白。這說明毛霉發酵有效地提高毛豆腐的抗氧化活性。整體上，毛豆腐pH 4.5水提取物對2種自由基的清除率活性變化幅度最小，低于毛豆腐pH 6.5水提取物，但大于大豆分離蛋白，而且發酵時間越長其清除活性均呈現增加的趨勢，這與他人研究的腐乳前期發酵過程中自由基清除活性的變化一致［21］。尤為突出的是，毛豆腐的乙醇提取物顯示出比毛豆腐的水提取物有更高的自由基清除活性，并且60%乙醇溶液提取出的提取物的自由基清除活性最大，20%乙醇溶液提取出的提取物的自由基清除活性最小。所以，極有可能是由于乙醇溶液的非極性增加，導致提取物中具有更多的疏水性小肽和氨基酸，從而提高提取物的自由基清除活性。之前的研究也揭示貝類發酵物的抗氧化活性與提取物中氨基酸的疏水性有關［22］。

是否由于大豆中存在的異黃酮被乙醇溶液提取，從而對乙醇提取物的自由基清除活性評價產生了影響。在研究過程中，我們對乙醇溶液提取物進行活性碳處理，利用活性碳吸附作用除去可能存在的異黃酮。結果發現，毛豆腐乙醇提取物經活性碳處理后，對2種自由基的清除率確實有所降低，但是降低幅度約為7%～9%，可能與活性炭對部分肽或氨基酸的吸附作用有關。不過可以肯定的是，異黃酮對提取物的自由基清除活性評價影響甚微。另外，其他人在對豆豉的抗氧化性研究中也發現，抗氧化性與可溶性成分有關，而與異黃酮關系不大［23］。所以，我們的結論與其一致。至于毛豆腐提取物中哪些肽成分具有較好的自由基清除活性，還有待于進一步的研究。

2.5 排阻色譜分析圖譜

由于發酵9d后毛豆腐的5種提取物的自由基清除活性均最好，所以利用排阻色譜對這5種提取物進行分析，結果如圖1所示。

圖1 排阻色譜分析圖譜

在標準樣品中，細胞色素C、胰島素、氧化型谷胱甘肽、L-酪氨酸的分子質量分別為12200、5733、612.6、181.2，相應的洗脫體積分別為3.5、8.6、11.9、19.2mL。從圖1B、圖1C中可以看出，5種提取物主要組成成分的洗脫體積范圍大致在9.8～21.2mL之間。因此，根據標準樣的洗脫體積，初步斷定5種提取物中大分子質量物質為分子質量小于5733的肽類，而小分子質量的物質則為游離氨基酸，表明毛豆腐發酵過程中一些大豆蛋白充分降解，產生了肽和游離氨基酸。從圖1B、圖1C的譜圖還可以看出，不同溶劑得到的提取物，其組成還是有一定差別的，例如，pH6.5水提取物中，與pH4.5水提取物相比，就含有更多的大分子質量肽，而3種乙醇液提取物的組成也是有區別的。乙醇的含量越低，提取物中大分子質量的肽也就相對多一些。這些組成的差異，可能是導致其自由基清除活性不同的原因。

3 結論

3.1 在0～9d的發酵過程中，毛豆腐的水分含量逐漸降低，蛋白質含量逐漸增加，同時水溶性蛋白質含量也有顯著增加。

3.2 利用5種提取劑:20%、40%、60%(v/v)乙醇溶液，pH4.5水，pH6.5水;分別對發酵時間不同的毛豆腐進行提取，所得到的各種提取物中，可溶性蛋白質的提取率隨毛豆腐發酵時間延長而增加，最高可達到33.9%;pH6.5水提取物可溶性蛋白質提取率高于pH4.5水提取物;隨著提取溶劑中乙醇濃度的增加，乙醇溶劑提取物中可溶性蛋白質的提取率下降。

3.3 各種提取物中蛋白質的水解度在17%～45%，并隨毛豆腐發酵時間的延長而增加，說明提取物蛋白質成分為大豆蛋白質的水解物。pH4.5水提取物中蛋白質的水解度，大于pH6.5水提取物中蛋白質的水解度;并且，隨著提取溶劑中乙醇濃度的增加，提取物中蛋白質的水解度也增加。

3.4 隨著毛豆腐發酵時間的延長，提取物對DPPH、ABTS自由基的清除活性也增加，大小順序為:60%乙醇溶液提取物＞40%乙醇溶液提取物＞20%乙醇溶液提取物＞pH6.5水提取物＞pH4.5水提取物。結果顯示，提取溶劑對提取物的自由基清除活性具有影響作用，但有待于進一步的分析研究。

3.5 排阻色譜分析結果表明，發酵9d后，毛豆腐的各種提取物的主要組成為肽與氨基酸，不同提取物的組成有區別，可能是其自由基清除活性不同的重要原因。

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Study on the free radical scavenging activity of the extracts from mao-tofu in vitro

HANG Mei，ZHAO Xin-huai*
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Mao-tofu fermented for 3，5，7，9 days were extracted by five extraction solvents，including 20%，40%， 60%ethanol solution(v/v)，pH 4.5 and pH 6.5 water，respectively.The extracting yield of the proteins and the degree of hydrolysis of the proteins in the extracts were analyzed.The free radical scavenging activities of the extracts on DPPH，ABTS radicals were evaluated.The results showed that the longer the fermentation time was，the higher the extracting yield and the degree of hydrolysis of the proteins in the extracts were，and the higher the free radical scavenging activity of the extract was.It was also found that the free radical scavenging activities of ethanol extracts of mao-tofu were higher than water extracts，and the free radical scavenging activity of ethanol extracts increased with the concentration of ethanol applied in extraction.The analysis results from size exclusion chromatography confirmed that the five extracts obtained from mao-tofu fermented for 9 days were mainly peptides and amino acids，indicating the occurrence of hydrolysis of soybean proteins.

mao-tofu;extracts;extracting yield;degree ofhydrolysis;radical scavenging activity;size exclusion chromatography

TS214.2

A

1002-0306(2011)09-0169-05

大豆在發酵過程中產生多種抗氧化成分，例如多肽類。許多研究證明，大豆發酵制品比沒發酵之前顯示出更強的抗氧化活性［1］。Yang等的研究表明，發酵后的大豆顯示出更強的DPPH自由基清除能力［2］。Easki等報道，日本豆醬、納豆和天貝在發酵過程中產生了抗氧化成分［3］。毛豆腐是我國徽州的著名小吃，在我國有較大的消費人群［4］，它是利用豆腐通過微生物發酵所制成的一種干酪型產品，可以有效地提高大豆的消化率和生物價［5］。毛霉是生產毛豆腐的主要菌種，這主要是因為毛霉能分泌蛋白酶，將蛋白質分解生成氨基酸和多肽等，使食品具有獨特的風味和細膩的質地，受到消費者的喜愛。以往對毛豆腐的研究主要偏重于發酵過程中的化學成分、微細結構和組織形態的變化［6］，而對毛豆腐中蛋白質的生物活性的研究甚少。過去的研究工作表明，大豆蛋白肽具有抗氧化［7］、降膽固醇［8］、降血壓［9-10］、提高免疫力［11］、抗癌［12］等生物功能。因此，研究毛豆腐中肽類的抗氧化性質很有必要。本研究采用5種不同溶劑提取發酵后的毛豆腐樣品，分析各種提取物中蛋白質的含量及水解程度，并評價各提取物對兩種自由基的體外清除活性，確定發酵時間和溶劑種類對毛豆腐提取物抗氧化能力的影響;然后利用排阻色譜初步評價了提取物的組成情況。

2010-08-31 *通訊聯系人

杭梅(1984-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:食品科學。