猴頭菌發酵刺五加后多糖與紫丁香苷的含量變化研究

陳麗艷，金 爽，張 迎，李 月，王偉明

(黑龍江省中醫研究院，黑龍江哈爾濱150036)

猴頭菌發酵刺五加后多糖與紫丁香苷的含量變化研究

陳麗艷，金 爽，張 迎，李 月，王偉明*

(黑龍江省中醫研究院，黑龍江哈爾濱150036)

研究猴頭菌發酵刺五加后多糖及紫丁香苷的含量變化，為新藥源開發提供理論依據。以蒽酮-硫酸法測定猴頭菌發酵刺五加前后多糖的含量，并采用高效液相色譜法對發酵前后紫丁香苷的含量進行檢測。結果顯示，猴頭菌發酵刺五加后多糖的質量分數由發酵前的0.3%提高到0.7%，多糖的含量提高了133%;而刺五加原藥材中紫丁香苷的含量為0.0096%，發酵后在紫丁香苷標準峰對應處未出峰，而是在其它位置出現了三個新的譜帶。猴頭菌發酵刺五加后多糖含量顯著提高，可以起到協同或增加猴頭菌及刺五加藥效的作用;發酵物中紫丁香苷成分未檢出，是由于發酵后紫丁香苷在微生物酶的作用下降解轉化為其它物質，有利于提高生物利用度，為新藥源的開發奠定了基礎。

猴頭菌，刺五加，發酵，多糖，紫丁香苷

1 材料與方法

1.1 材料與設備

紫丁香苷標準品 購于中國藥品生物制品檢定所，批號111574-200502，規格20mg;葡萄糖對照品購于中國藥品生物制品檢定所，批號110833-200503;其他試劑 均為色譜純或分析純;猴頭菌 購于黑龍江省微生物研究所，菌種名稱猴頭菌(Hericium erinaceus)，編號8415;刺五加 購于黑龍江省藥材公司，經黑龍江省中醫研究院付克志研究員鑒定為Acanthopanax senticosus(Rupr.etMaxim.)Harms。

UV2550紫外-可見分光光度計 上海第三分析儀器廠;KQ-300DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器郁良公司;FA1104分析天平 上海天平儀器廠;KE·WEI電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永新實驗儀器設備廠;PH140A型培養干燥箱 上海一恒科技有限公司;SHB-IIIA循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;YS-280B手提式不銹鋼蒸汽消毒器 上海三申醫療器械有限公司;AF-20A密封型搖擺式中藥粉碎機 溫嶺市奧力中藥機械有限公司;SSI型高效液相色譜儀 天津市蘭博實驗儀器設備有限公司;Diamonsil C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm) 中國迪馬公司。

1.2 發酵菌質的制備

以猴頭菌為發酵菌種，CPDA培養基進行培養傳代，以刺五加為藥性基質加入麩皮15%，碳酸鈣1%，硫酸鈣1%及藥材總重1.5倍體積的蒸餾水浸泡12h作為發酵培養基。傳代后的菌液接種于高壓滅菌后的發酵培養基上，28℃恒溫培養40d。發酵好的藥性菌質先自然干燥，再于40℃烘干，粉碎備用。

1.3 多糖含量測定

1.3.1 樣品多糖提取 取刺五加原藥材及刺五加發酵樣品各100g，按照固液比1∶10的比例加水于80℃水浴浸提兩次，每次4h，合并濾液并濃縮至100mL，冷卻后加乙醇至濃度為30%，靜置過夜，真空抽濾，棄去濾渣。濾液加乙醇至濃度為80%，操作同上，用無水乙醇沖洗濾渣至粉末狀，干燥至恒重，即為多糖。

1.3.2 刺五加未加菌發酵培養基對照樣品的多糖提取 刺五加中加入1.5倍體積蒸餾水浸泡12h，并加入麩皮15%，碳酸鈣1%，硫酸鈣1%，滅菌后不接種猴頭菌，在相同條件下進行發酵處理，作為對照，同樣稱取100g，同法提取多糖。

1.3.3 蒽酮硫酸法方法學考察

1.3.3.1 線性關系考察 精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品20mg，加蒸餾水溶解定容至100mL，配成0.2g/L的葡糖糖標準液。再精密吸取標準液1、2、3、4、5mL置于10mL容量瓶中，以蒸餾水定容搖勻，得系列對照品溶液。稱取0.2g蒽酮，加100mL濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻置于冰箱中(現配現用)。

精密吸取上述系列對照品溶液1.0mL，置于10mL具塞試管中，將試管置于冰水中，分別向試管中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4mL，待各管加完后同時搖勻，沸水浴中準確加熱10min，取出用冷水迅速冷卻至室溫，放置10min，于620nm處測定吸光度。另精密吸取蒸餾水1.0mL，同法操作，作為空白對照。以吸光度值為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3.2 精密度、重現性、顯色穩定性和加樣回收率實驗 取葡萄糖對照品溶液，連續測定5次，進行精密度實驗;精密稱取同批樣品粉末5份，按照樣品中多糖提取步驟提取樣品溶液，精密吸取樣品溶液各1.0mL，分別置于10mL具塞試管中，進行重現性實驗;精密吸取制得的某一樣品溶液1.0mL，分別在顯色后0、10、20、40、60、80、100、120min測定吸光度，進行顯色穩定性實驗;精密稱取已知含量的同批5份樣品，精密加入一定量的葡萄糖對照品，進行加樣回收率實驗，計算回收率。

1.3.4 多糖含量測定

1.3.4.1 樣品溶液制備 分別取刺五加原藥材，刺五加發酵物及刺五加未加菌發酵培養基對照提取的3種多糖樣品各12mg，精密稱定，加蒸餾水定容至100mL量瓶中，以蒽酮-硫酸法［9］測定含量，實驗平行3次。

1.3.4.2 多糖含量測定 精密吸取1.3.4.1制得的樣品溶液各1.0mL于具塞試管中，按1.3.3的方法測定吸光度，由回歸方程計算供試液中葡萄糖濃度。多糖含量(%)=CD/W×100%

其中:C:樣品溶液中葡萄糖的濃度(g/L);D:樣品溶液的稀釋倍數;W:樣品重量(g)。

1.4 紫丁香苷含量的測定［10－11］

1.4.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(4.6mm× 250mm，5μm);流動相:乙腈-水(10∶90);柱溫:室溫;紫外檢測波長265nm，流速0.08mL/min，進樣量10μL。

1.4.2 對照品溶液制備 精密稱取紫丁香苷1mg置于10mL容量瓶中，以甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻得濃度0.10g/L紫丁香苷對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液制備 分別精密稱取刺五加原藥材，刺五加發酵物，刺五加未加菌發酵培養基對照及麩皮15%、碳酸鈣1%、硫酸鈣1%混合物的粉末各約2g，精密加入甲醇20mL，稱重，記錄重量，浸12h后，超聲處理(250kw，36kHz)30min，靜置至室溫，補足重量，過濾后取續濾液備用。

1.4.4 方法學考察

1.4.4.1 線性關系考察 取紫丁香苷對照品溶液(0.10g/L)。分別精密吸取對照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5mL溶于10mL容量瓶中，分別進樣10μL。按上述色譜條件測定峰面積。以紫丁香苷進樣量Y為縱坐標、峰面積X為橫坐標繪制標準曲線。

1.4.4.2 精密度、重復性和回收率實驗 精密吸取紫丁香苷對照品溶液(0.10g/L)10μL，重復進樣5次，測定紫丁香苷峰面積，進行精密度實驗;取刺五加原藥材樣品溶液，平行5次取樣，制備供試品溶液，進行重復性實驗;采取加樣回收法，取已知質量分數(含紫丁香苷為0.096mg/g)刺五加原藥材樣品約1.0g，精密加入紫丁香苷對照品溶液(0.10g/L) 1.0mL，制備供試品溶液，計算回收率。

2 結果與討論

2.1 多糖含量測定

2.1.1 方法學考察 如圖1所示，在20～100μg范圍內葡萄糖的含量與吸光度呈良好線性關系。且本方法精密度和重現性良好，RSD值分別為0.67%和2.67%。顯色穩定性結果顯示該樣品在20～120min內吸收值基本穩定。平均回收率為97.52%，RSD為2.55%，回收率較好。各項結果均表明本方法可行。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.1.2 多糖含量測定結果 刺五加原藥材、刺五加發酵物及刺五加未加菌發酵培養基對照提取的3種多糖樣品含量測定結果見圖2，結果顯示刺五加經猴頭菌發酵后多糖質量分數由原藥材的0.30%提高到0.70%，刺五加未加菌發酵培養基對照中，多糖質量分數0.39%，發酵后多糖的含量提高了133%。

圖2 刺五加發酵前后多糖質量分數

猴頭菌發酵刺五加后多糖質量分數顯著增加，一方面由于刺五加屬木質類，經發酵后猴頭菌產生的酶系能夠使木質素和纖維素等刺五加細胞壁組成成分降解，產生大量多糖;另一方面猴頭菌在刺五加藥性基質生長旺盛時也會產生大量的多糖。

2.2 紫丁香苷含量測定

2.2.1 方法學考察 經計算得回歸方程為Y= 5.09535×107X-0.312986，r=0.9997，表明紫丁香苷在0.05～0.25μg與峰面積具有良好的線性關系。且精密度、重復性良好，RSD值分別為1.18%和1.90%，平均回收率為98.54%，RSD 2.12%(n=5)，表明此方法可行，能夠滿足定量分析的要求。

2.2.2 紫丁香苷含量測定結果 在確定的色譜條件下，分別測定刺五加原藥材，刺五加發酵物，刺五加未加菌發酵培養基對照及麩皮、碳酸鈣、硫酸鈣混合物中紫丁香苷含量，進樣量10μL。由表1可知，刺五加原藥材紫丁香苷含量0.0096%，刺五加發酵后紫丁香苷未檢出，刺五加未加菌發酵培養基對照紫丁香苷含量0.0025%，麩皮、碳酸鈣、硫酸鈣混合物中紫丁香苷峰譜對應處沒有干擾;如圖3所示。

將刺五加發酵前后HPLC圖按保留時間分為a(0～5min)，b(5～10min)，c(10～15min)，d(15～20min)，e(20～25min)五個保留時間區。由表2可見，a1、a2、a3、a4、b2在刺五加未加菌發酵培養基對照(C)及麩皮、碳酸鈣、硫酸鈣混合物(D)中均出現，說明這四條譜帶為來自麩皮、碳酸鈣、硫酸鈣的混合物;刺五加發酵物(B)中a4、b3、d1三條譜帶全部消失，而產生了a5、b5、e1三條新譜帶。

表2 刺五加發酵前后HPLC出峰的結果

圖3 刺五加發酵前后HPLC圖

表1 紫丁香苷含量檢測結果(n=5)

3 結論

刺五加經猴頭菌發酵后多糖的含量顯著提高，有利于提高其生物活性及利用度;刺五加中的紫丁香苷被猴頭菌發酵轉化后，含量顯著減少，表明已被猴頭菌分解轉化。發酵后的高效液相圖譜中新生成了三條新譜帶，這三種物質將進一步通過液質聯用及核磁技術進行檢測。

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The content analysis of the crude polysaccharides and syringin in Acanthopanax senticosus fermented by Hericium erinaceus

CHEN Li-yan，JIN Shuang，ZHANG Ying，LI Yue，WANG Wei-ming*
(Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150036，China)

To study the content of the crude polysaccharides and syringin in Acanthopanax senticosus fermented by Hericium erinaceus，and it would be offer the theoretical basis for developing the new resources of Traditional Chinese Medicine.The content of the crude polysaccharides and syringin in Acanthopanax senticosus before and after fermentation were determined by anthrone-sulphuric acid and HPLC methods，respectively.The results showed that the mass percentage of crude polysaccharides in the raw material was 0.3%，and it rose to 0.7%after fermented.The content of syringin in the raw material was 0.0096%，the peak was disappeared at the same retention time of syringin after fermented，and three new peaks were found.The content of crude polysaccharides in the fermented products of Acanthopanax senticosus was increased significantly，and the pharmacological effect may be stronger than before;syringin was disappeared in the fermented products of Acanthopanax senticosus，the reason may be that syringin has been transformed to other components with the efforts of microbiology enzymes. It was propitious to raise bioavailability and establishes a research foundation for the new Traditional Chinese Medicine resource development in the future.

Acanthopanax senticosus;Hericium erinaceus;fermentation;polysaccharides;syringin

TS201.3

A

1002-0306(2011)09-0184-04

猴頭菌(Hericium erinaceus)隸屬于擔子菌門、猴頭菌科，為藥食兼用真菌，具有助消化、降血糖及抗氧化等藥理活性，其有效成分為多糖。刺五加為五加科，五加屬植物刺五加 Acanthopanax senticosus (Rupr.etMaxim.)Harms的干燥根莖［1］，具有提高免疫力、抗疲勞、抗腫瘤等藥理活性，其有效成分為多糖和苷類［2］。雙向發酵技術使藥物經體外微生物大量酶系分解轉化［3-4］，可提高藥效及有效成分提取率，產生新藥效，并為藥物活性成分結構修飾提供了新途徑［5-7］。研究采用雙向發酵技術［8］，用猴頭菌發酵中藥刺五加，實現苷類成分在體外轉化為苷元，以利于人體吸收;多糖含量提高有利于藥效的增強。實驗采用高效液相色譜法對發酵物中紫丁香苷含量進行對比分析，并利用蒽酮-硫酸法對其多糖含量進行檢測。

2010-09-14 *通訊聯系人

陳麗艷(1971-)，女，副主任藥師，從事中藥研究及開發。

十一五國家科技支撐計劃(2006BAI06A20-11)。