平菇基因組DNA提取方法的研究

閆 燕，許文濤，蘇春元，羅云波，王一南，谷新晰，戴蘊青，田洪濤，*

(1.河北農業大學食品科技學院，河北保定071001; 2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083; 3.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心(北京)，北京100083)

平菇基因組DNA提取方法的研究

閆 燕1，2，3，許文濤2，3，蘇春元2，羅云波2，王一南3，谷新晰1，戴蘊青2，3，田洪濤1，*

(1.河北農業大學食品科技學院，河北保定071001; 2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083; 3.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心(北京)，北京100083)

以實驗室自行培育的平菇為實驗材料，分別使用CTAB法、SDS-CTAB法以及高鹽酶解法提取平菇基因組DNA，并通過紫外分光光度計、限制性酶切及PCR檢測來衡量基因組質量。結果表明，使用CTAB法很難得到高質量的基因組DNA，OD260/280僅為1.5左右，而且伴有較多的雜質，電泳條帶拖尾嚴重;使用EcoRI限制性酶對其進行酶切分析，效率較低，同時PCR檢測不能得到有效擴增;而使用優化后的SDS-CTAB法及高鹽酶解法提取平菇DNA，能夠獲得質量高、純度好的基因組DNA，OD260/280基本保持在1.8～2.0之間，電泳條帶較為清晰均一，使用EcoRI限制性酶對其進行酶切分析，酶切效果較好，并且DNA質量能夠滿足PCR檢測的模板要求。說明SDS-CTAB法以及高鹽酶解法提取的平菇DNA能夠滿足分子水平操作的要求，兩者相比，前者成本較低，后者產率較高。

平菇，基因組DNA，提取方法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平菇 實驗室自行培育、分離，研究部分為菌皮、菌肉、菌褶以及菌柄四部分，分別標記為1、2、3、4號;DL2000 DNA marker(300ng/5μL) 大連寶生物工程有限公司;RNase、溶壁酶(500U/mL)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)、各10mmol/L的四種脫氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合液 購自Sigma (美國)公司;CTAB緩沖液，100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，6mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，20g/L CTAB，苯酚/氯仿溶液1∶1(v/v)，10×PCR Buffer，100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，0.2%β-巰基乙醇(v/v)，2%SDS緩沖液，蛋白酶K(20mg/mL)，1×TE緩沖液，1mol/L Tris-HCl (pH8.0)100mL，500mmol/L EDTA(pH8.0)20mL;其它試劑或溶劑 均為分析純或生化純。

電熱恒溫水浴鍋HH-SY2HUI 北京市長風儀器儀表公司;ASP-3700型紫外分光光度計 美國ACTGene公司;電子天平FA100413 上海越平科學儀器有限公司;電泳儀 北京市六一廠;PHX型智能生化培養箱 寧波萊福科技有限公司;PCR儀 BIO -RAD ALD-1244;紫外投射儀GelDoc-It PN 95-0441-02 ENFO-980179振蕩搖床。

1.2 DNA的提取方法

1.2.1 CTAB法 摘取平菇菌蓋、菌肉、菌褶及菌柄四部分，加入少許液氮進行研磨，分別稱取大約200mg樣品，加入800μL預熱到65℃的CTAB提取液，充分振蕩，放入65℃水浴鍋中1～2h。取出EP管，于4℃，12000r/min離心10min。吸取1mL上清液移入新管中，加入等體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，于 4℃，12000r/min離心10min。吸取上清液移入新管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)。小心倒掉上清液，加入2/3體積的異丙醇，混勻后，置于-20℃下放置30min。取出樣品，于4℃，12000r/min離心10min，倒掉上清液后，加入700μL 70%乙醇，用槍頭吹吸，使沉淀重懸于乙醇中，于4℃，12000r/min離心10min，小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，控干上清液，置于超凈工作臺上吹干10～15min。晾干后，加入50μL提前在水浴鍋中預熱的滅菌水，使沉淀充分溶解，加入2μL RNase放置于37℃水浴鍋中消化30min，即為所得DNA提取液。

1.2.2 SDS-CTAB提取法 摘取新鮮的平菇菌蓋、菌肉、菌褶及菌柄四部分，加入少量海砂，進行液氮研磨，取2.0mL EP管提前放入液氮遇冷，分別稱取大約200mg樣品，迅速加入 600μL預熱到 65℃的CTAB提取液，充分重懸沉淀，放入65℃搖床中1h，1200r/min。取出樣品，加入400μL SDS提取液和3μL蛋白酶K，充分混勻并放回搖床中。取出 EP管，于4℃，12000r/min離心10min。吸取1mL上清液移入新管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，于4℃，12000r/min離心10min。吸取上清液移入新管中，重復前一步操作。小心倒掉上清液，加入2/3體積的異丙醇，混勻后，置于-20℃下放置30min。取出樣品，于4℃，12000r/min離心10min，倒掉上清液后，加入700μL 70%乙醇，用槍頭吹吸，使沉淀重懸于乙醇中，于4℃，12000r/min離心10min，小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上控干上清液，置于超凈工作臺上吹干10～15min。晾干后，加入50μL提前在水浴鍋中預熱的滅菌水，使沉淀充分溶解，加入2μL RNase放置于37℃水浴鍋中消化30min，即為所得DNA提取液。

1.2.3 高鹽酶解法 摘取平菇菌蓋、菌肉、菌褶及菌柄四部分，加入少量海砂，進行液氮研磨，稱取大約200mg樣品，加入400μL TE緩沖液，充分振蕩。向每支樣品加入2μL溶壁酶，顛倒混勻，放入搖床30℃，1200r/min，1h。取出樣品，于4℃，12000r/min離心10min，小心將上清液移入新管中，加入400μL CTAB提取液充分混勻，放入搖床中65℃，1200r/min，30min。取出樣品向其中加入200μL SDS提取液和3μL蛋白酶K，放回搖床中65℃，1200r/min，30min。取出樣品，于4℃，12000r/min離心10min，吸取1mL上清液移入新管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，于4℃，12000r/min離心10min。吸取上清液移入新管中，重復上述抽提一次，吸出上清液，加入600μL異丙醇，1/5體積的醋酸鉀，混勻后，置于-20℃放置下20min。取出樣品，于4℃，12000r/min離心 10min，小心倒掉上清液，加入700μL 70%乙醇，用槍頭吹吸，使沉淀重懸于乙醇中，于4℃，12000r/min離心10min，小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上晾干上清液，置于超凈工作臺上吹干10～15min。晾干后，加入50μL提前在水浴鍋中預熱的滅菌水，使沉淀充分溶解，加入2μL RNase放置于37℃水浴鍋中消化30min，即為所得DNA提取液。

1.3 平菇基因組DNA的電泳檢測及純度分析

基因組DNA提取后，用1×TAE溶液配制1%的瓊脂糖液，加入0.5μg/mL的EB，制成瓊脂糖凝膠。取2μL DNA溶液與0.5μL點樣緩沖液混合后點樣。隨后在120V恒定電壓條件下進行電泳，時間約為20min。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外投射儀上成像，分析電泳結果。

取提取后的平菇DNA溶液2μL，用ASP-3700型紫外分光光度計測定260nm和280nm下的紫外吸收值及所提取樣品的濃度。

1.4 平菇基因組DNA的酶切分析

在0.5mL離心管中依次加入3μg平菇DNA，2μL 10×Buffer，0.5μL EcoRI(10U/μL)以及2μL乙酰BSA(10μg/μL)，加無菌ddH2O至終體積20μL，瞬時離心后在37℃水浴鍋中溫育4h。用1%瓊脂糖凝膠對酶切產物進行電泳(120V恒壓電泳20min)，電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外投射儀上成像，分析酶切結果。

1.5 PCR檢測

對所提基因組DNA，選用18sRNA作為內標進行PCR擴增，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。引 物 序 列 為 Primer - F 5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3'，Primer-R5'-CGTGCTAGGATTGGGTAAT-3'(上海生工生物工程有限公司合成)。PCR反應的總體積為30μL，其中，10×PCR buffer 3μL，dNTP 2.4μL，Primer-F 1.5μL，Primer-R 1.5μL，Taq酶0.2μL，模板2μL(約50ng)。擴增條件:95℃3min，95℃15s，58℃5min，72℃10min，35個循環，反應儀器為ABi2700 thermal cycle。

2 結果與分析

2.1 DNA的純度及濃度

3種方法提取的DNA質量結果見表1～表3和圖1，圖表中編號A、B、C分別表示CTAB法、SDSCTAB法以及高鹽酶解法，1～4分別表示平菇的菌皮、菌肉、菌褶、菌柄四個部位。紫外分光光度計測定的260nm和280nm下的紫外吸收值分別代表了鹽濃度、核酸、蛋白質等有機物的吸光度值。高質量的DNAOD260/280應在 1.8～2.0之間，當 OD260/280小于 1.8時，DNA中存在蛋白質的污染，當 OD260/280大于2.0時，DNA提取物中RNA含量較高。從表中數據分析得出，在方法B、C中OD260/280基本保持在1.8～2.0之間，說明SDS-CTAB法以及高鹽酶解法所提取的DNA質量較好;CTAB法中OD260/280值低于1.8，說明溶液中的蛋白質等有機物的污染比較明顯。

表1 CTAB法

表2 SDS-CTAB法

表3 高鹽酶解法

2.2 DNA分子的完整性

DNA電泳結果表明(圖1)，CTAB法提取的DNA量較少，而且存在嚴重拖尾現象，并且有斷裂DNA干擾，經RNase消化后，仍有很多RNA殘留。使用SDS-CTAB提取的平菇各組織DNA產率相對較高，電泳條帶無拖尾，經RNase酶消化后，僅殘留少量的RNA。與上述兩種方法相比，高鹽酶解法提取的平菇各組織DNA產率最高，而且電泳條帶均一。其次，通過比較可以看出，經過相同時間的RNase消化，CTAB法提取的平菇基因組 DNA中RNA殘留量最多，若要進行后續實驗，需延長RNase酶的消化時間。

圖1 三種方法提取平菇基因組DNA的電泳圖譜

2.3 平菇基因組DNA的酶切鑒定

對使用CTAB法(A1～A4)、SDS-CTAB法(B1～B4)以及高鹽酶解法(C1～C4)提取的平菇DNA進行酶切鑒定，酶切產物的電泳圖譜如圖2所示。可以看出，CTAB法所提取的平菇DNA條帶有拖尾現象，很難被EcoRI酶切;而SDS-CTAB法、高鹽酶解法所提取的平菇DNA樣品都能被EcoRI酶切，酶切圖譜呈彌散狀，說明高質量的基因組DNA雜質很少，而且其鹽濃度不會抑制限制性內切酶的活性，而質量較差的基因組DNA限制性內切酶的酶切效率很低，這兩種方法提取的基因組DNA純度較好，可以滿足酶切等分子生物實驗的要求。

圖2 三種方法提取的基因組EcoRI酶切圖譜

2.4 平菇基因組的PCR擴增分析

以CTAB法、SDS-CTAB法以及高鹽酶解法提取的DNA進行PCR擴增，所得PCR產物電泳圖譜如圖3所示。以CTAB方法提取的基因組作為模板，如A1～A4所示，電泳條帶模糊，甚至不能得到有效擴增，很可能是由于RNA、多糖、多酚等雜質的存在，從而影響了基因組DNA的純度，抑制了PCR反應的進行;而以SDS-CTAB法、高鹽酶解法所提取的平菇組織DNA為模板擴增的目的條帶清晰、整齊，擴增效率高。結果表明，SDS-CTAB法、高鹽酶解法兩種優化方法能夠有效地提取高質量的平菇基因組DNA，并且可以滿足相關分子生物學實驗的要求。

圖3 PCR擴增圖譜

3 討論

為獲得高質量、高純度的DNA基因組，本實驗選擇了平菇的菌皮、菌肉、菌褶、菌柄分別進行提取。菌褶中含有大量的擔子，是有性繁殖的重要途徑，因此也是細胞含量較豐富的組織，并且相對菌肉來說取材容易，是提取子實體基因組的首選位置。平菇菌皮由于紫外線的照射通常大部分呈灰色，含有較多的酚類物質。Katterman，F.R.H和 Shattuck，V.l. An［5］曾報道由于光照強度的影響，野生型菌比溫室培養菌含有更高的單寧酸以及多酚復合物。因此提取菌褶時，會出現大量的蛋白雜質，從而很可能影響DNA的質量。菌柄由于較為嚴重的木質化、纖維化，細胞組織老化、變形，增加了提取的難度，因此只能獲得較為有限的基因組DNA，而以這部分組織的基因組作為模板進行PCR擴增，如圖3中A4所示，不能得到有效擴增。其次，老化組織比幼齡組織包含更多的多酚、萜類物質［6］，這類物質通常為灰色，在研磨時從液泡中釋放出來，不可避免地與DNA結合，在后續工作中很可能成為影響模板DNA質量的因素。因此，取材時應選用新鮮幼齡樣品作為研究對象。

通過已有文獻報道的平菇DNA提取實驗方法，我們可以總結出以下幾處共同點:首先，對樣品進行前處理，如用液氮對組織研磨［7-8］，對菌絲進行凍干處理，加入玻璃珠或其它具有破壞性的微小顆粒進行細胞研磨［9］，加入裂解液進行劇烈振蕩等［10］，使用緩沖液對DNA進行抽提，并且對DNA進行純化［11］。而這些方法的不同之處在于提取DNA所需時間，最終提取DNA的純度、含量以及所用的抽提試劑等方面。針對眾多的提取方法，我們嘗試使用CTAB提取方法，加入β-巰基乙醇和PVP［7］等進行提取，得到基因組是粘性很強的灰褐色提取物，不能滿足PCR等后續實驗的模板DNA質量要求。

如何獲得高質量、高產率的基因組DNA取決于細胞破碎是否徹底［12］，而平菇細胞壁較厚，需要特殊的處理才能使基因組有效釋放。在樣品前處理時加入海砂，增加了樣品之間的摩擦，使得液氮研磨的更加充分、快捷，從而縮短了樣品在外界的暴露時間，降低了交叉污染率，也可有效抑制胞內酶對核酸的降解作用。

在裂解過程中，通過均質化使得樣品充分混勻，減少了傳統方法中水浴鍋使用時進行振蕩帶來的不便。由于裂解液中加入高濃度的CTAB與SDS，可有效地與酸性多糖相結合形成復合物，并且蛋白酶K在SDS存在的情況下能有效地與蛋白結合，減少蛋白等抑制因子的存在，加入高鹽成分，能有效地在抽提過程中減少多糖、多酚物質的污染。Sangwan等曾報道使用氯仿∶異戊醇(24∶1)代替酚仿抽提，原因在于后者獲得的基因組質量較差，酚污染嚴重［13］。正如SDS-CTAB法使用氯仿∶異戊醇(24∶1)獲得了較純的基因組DNA，并且減少了飽和酚在PCR反應中的抑制作用，從而利用異丙醇沉淀基因組DNA。

但由于平菇屬于高等真菌，細胞壁中主要以幾丁質構成其骨架結構，與細菌、植物都有很大差異，對于傳統的提取方法很難使得細胞內含物有效釋放，因此，方法B在裂解前加入溶壁酶進行酶解，從而有效破碎細胞壁，使得內含物充分釋放，獲得高產率的基因組DNA。另外，高濃度的NaCl與醋酸鉀能獲得較高的產率，Jobes［14］等人就采用過這個方法。

綜上所述，本文中SDS-CTAB法、高鹽酶解法成功提取出質量較好、純度較高的平菇子實體基因組DNA，兩種方法相比，前者成本較低，后者產率較高，用這兩類方法提取的平菇基因組DNA為菌種鑒定、基因分型等方面提供了可靠的保證，同時對于真菌基因組的提取起到很大輔助作用，也為今后進一步開展高等真菌分子生物學方面的研究奠定了基礎。

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Study on the methods of extraction of Pleurotus ostreatus genomic DNA

YAN Yan1，2，3，XU Wen-tao2，3，SU Chun-yuan2，LUO Yun-bo2，WANG Yi-nan3，GU Xin-xi1，DAI Yun-qing2，3，TIAN Hong-tao1，*
(1.Agricultural University of Hebei，College of Food Technology，Baoding 071001，China; 2.China Agricultural University，College of Food Science and Nutrition Engineering，Beijing 100083，China; 3.Supervision and Testing Center for GMOs Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

Pleurotus ostreatus(culture by ourselves)genomic DNA were extracted by three methods，which were the methods of CTAB method，SDS-CTAB method，and high-concentration salt precipitation method，respectively，analyzed by ultraviolet spectrophotometer，digested by restriction enzymes of EcoRI and PCR amplified.The results proved Pleurotus ostreatus genomic DNA was really difficult to isolated genomic DNA by CTAB method，the ratio of OD260/280was only 1.5，digested by EcoRI inefficiency and PCR amplification useless.The other two methods were proved efficiently，the ratio of OD260/280was between 1.8～2.0 and had a clear fragment through agarose gel electrophoresis，digested by EcoRI efficiency and could be used as template for PCR amplification analysis，while the effect of extract genomic DNA by SDS-CTAB purification method and high-concentration salt enzymolysis method could be used for downstream analyses，the former was lower cost and the latter was more efficiency.

Pleurotus ostreatus;genomic DNA;extraction methods

TS255.1

A

1002-0306(2011)09-0190-04

平菇(Pleurotus ostreatus)又名糙皮側耳，屬于絲狀真菌，是真菌植物門的子實體，它是一種高蛋白，富含多種維生素以及多糖成分的高級食品，在食品保健、醫療衛生、生物化工等方面起著很重要的作用［1］。針對平菇的這些應用，通常利用分子生物學手段進行研究，如基因的組成、基因的表達等。基因組提取是分子生物學的基礎性研究，高效、穩定的基因組提取方法不僅可以減少工作量，并且能縮短鑒定、檢測周期，給實驗的順利進行提供可靠的幫助。目前已報道的平菇基因組提取方法中較為普遍應用的是CTAB法(溴代十六烷基三甲胺)，即在帶有培養基的情況下對絲狀菌絲提取基因組，而培養基中帶有大量的糖、瓊脂等物質給實驗帶來了很大的不便［2］。此外，平菇不同生長階段，所產生的次級代謝產物不同［3］，根據實驗需要，要對平菇子實體DNA進行研究，但平菇這類高等真菌存在較厚的細胞壁或膠囊狀物質，不利于裂解細胞釋放DNA［4］，并且由于大量的粘性多糖以及多酚類物質的存在，因此CTAB法很難得到高質量、高純度的DNA分子。本研究以優化的基因組提取方法和傳統方法進行比較，旨在探討高效、穩定提取平菇子實體各部分基因組DNA的方法，從而為優化高等真菌基因組的提取方法提供了有力參考，同時也為今后進一步開展食用菌分子生物學研究以及檢疫檢測奠定了基礎。

2010-12-08 *通訊聯系人

閆燕(1986-)，女，碩士研究生，研究方向:微生物酶資源開發。

國家高技術研究發展計劃(863)項目(2006AA10Z440);國家自然基金 (30800770);轉基因生物重大專項(2008ZX08012-001)。