傳統發酵豆制品中原核微生物多樣性的研究

陳 浩，樊 游，陳源源，左志銳，王正祥，*

(1.江南大學生物工程學院生物資源與生物能源研究中心，江蘇無錫214122; 2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

傳統發酵豆制品中原核微生物多樣性的研究

陳 浩1，2，樊 游1，2，陳源源1，2，左志銳1，王正祥1，2，*

(1.江南大學生物工程學院生物資源與生物能源研究中心，江蘇無錫214122; 2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

通過構建16S rDNA基因文庫的方法，對2份不同種類的豆醬樣品中原核微生物的多樣性進行了分析。另外動態監測了一份醬油醬醅樣品發酵過程中3個不同階段原核微生物的變化情況。研究表明，發酵樣品中的優勢乳酸菌為魏斯氏菌(Weissella cibaria，Weissella confusa，Weissella paramesenteroides)和嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcus halophilus)。另外還檢測到芽孢桿菌、葡萄球菌、腸桿菌、檸檬酸桿菌、泛菌、不動桿菌、庫特氏菌等細菌種群的存在。

傳統發酵豆制品，16S rDNA，微生物多樣性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傳統發酵黃豆醬、蠶豆醬各一份 采自安徽淮南;醬油醬醅三份 分別為發酵8、16、25d的樣品，采自江蘇無錫調味食品有限公司;培養攜帶T載體的Escherichia coli JM 109 含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基;pMD 18-T載體 寶生物工程(大連)有限公司;質粒提取、DNA純化試劑盒 QIAGEN公司;其他試劑 均為國產分析純。

表1 2種不同豆醬中的細菌菌群分布

遺傳分析儀Applied Biosystems 3130。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品總DNA的提取［5］取5g發酵樣品，加入5mL DNA抽提緩沖液100mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L EDTA pH8.0，100mmol/L磷酸鹽緩沖液pH8.0，1.5mol/L NaCl，1%CTAB，研磨，再加入5mL DNA抽提緩沖液，加入50μL蛋白酶 K 20mg/mL，37℃恒溫水浴1h，加入10%SDS 10mL，65℃恒溫水浴2h，每隔10～20min輕輕搖勻，溶液加到離心管中，8000r/min離心10min，取上清液加至一新管中，加入等體積的氯仿混勻，8000r/min離心10min，取上清液至已預冷的新管中，加入0.6倍體積預冷的異丙醇，-20℃保存20min，8000r/min離心15min，棄上清，用70%的乙醇洗滌沉淀，晾干后溶于去離子水中，RNase消化后進行瓊脂糖電泳檢測。

1.2.2 16S rDNA基因文庫構建 以提取的總DNA為模板，以原核生物通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')為上下游引物擴增16S rDNA基因。PCR條件為:94℃預變性5min; 94℃變性30s，52℃退火1min，72℃延伸90s，經過30個循環后，72℃再延伸10min。用0.8%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物。PCR產物經試劑盒純化后連接pMD 18-T載體，熱激轉化Escherichia coli JM 109感受態細胞。以氨芐青霉素(100μg/mL)抗性和藍白斑篩選來選擇陽性轉化子，并用質粒提取試劑盒提取質粒，通過電泳進一步驗證16S rDNA的插入片段。

1.2.3 序列分析和系統發育樹分析 陽性質粒轉化子經 BigDyeTerminatorv3.1 試劑盒 (Applied Biosystems)進行測序，測序上下游引物為M13-47 (5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')和M13-48(5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3')。測序后結果經過Sequence Scanner v1.0軟件分析后提交至NCBI-BLAST進行序列同源性分析，選擇相似性較高的相關菌株的基因序列，用ClustalW軟件進行序列多重比對［6］，用MEGA 4.0軟件包采用鄰接法(Neighbor-Joining)聚類分析和系統進化樹構建［7］。重復取樣1000次進行自展值分析以評估系統進化樹的拓撲結構穩定性［8］。

2 結果與分析

2.1 豆醬樣品中原核微生物的多樣性

兩種豆醬樣品均取自安徽淮南，但是兩種樣品中的原核微生物卻不盡相同。由表1可知，蠶豆醬中的乳酸菌為嗜鹽四聯球菌 (Tetragenococcus halophilus)，而黃豆醬中的乳酸菌則以魏斯氏菌為主(Weissella cibaria和Weissella confusa)，兩種樣品中乳酸菌分別占檢測出細菌菌群的20%和12%。

蠶豆醬中檢測到多種其他細菌，如腸桿菌(Enterobacter aerogenes，Enterobacter cancerogenus，Enterobacter sp.)、弗氏檸 檬 酸桿菌 (Citrobacter freundii)、成團泛菌(Pantoea agglomerans)、不動桿菌(Acinetobacter baylyi)等細菌種群都有被檢測到。

而黃豆醬中的優勢細菌種群則為芽孢桿菌屬的細菌(Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens)，占檢測總菌群的 72%，另外則有雞葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)和腸桿菌(Enterobacter aerogenes)的存在。

我們發現兩種相同產地的樣品中所檢測到的細菌菌群存在差異性，這可能與不同的制作原料和生產方法有關，也可能是發酵樣品的不同pH所導致的。

2.2 醬油醬醅中原核微生物的多樣性

通過對醬油發酵過程中的3個不同階段的樣品進行檢測，動態跟蹤了整個醬油發酵過程中的原核微生物的變化過程。總體來看，醬醅中的乳酸菌以魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides和 Weissella confusa)為主。分階段看，如圖1所示，發酵8d的樣品中，魏斯氏菌占61%，庫特氏菌(Kurthia gibsonii)占11%，芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)只占檢測到細菌的6%。在發酵16d的樣品中，魏斯氏菌降為42%，庫特氏菌和芽孢桿菌則占比上升，分別達到25%。在這個階段中，另有乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)被檢測到。而在發酵25d的樣品中，我們的研究只發現有芽孢桿菌的存在，而其他的細菌菌群都沒有被檢測到。

圖1 不同發酵階段醬醅中主要細菌菌群的變化

另外，在發酵8d的樣品中，我們檢測到的有22% 的克隆子分別與 Lactobacillus curvatu KH9 (AB494734)和 LactobacilluspontisLMG 14188 (AJ422033)的16S rDNA序列同源性達97%和95%，見圖2。從構建的系統進化樹上可以看出，檢測到的克隆子(JP3和JP10)與其典型菌株以較高的自展值(92%和88%)支持聚在一個系統進化分支上，表明它們都是乳桿菌屬(Lactobacillus)的一個種群。

圖2 根據檢測到的醬醅中原核微生物的16S rDNA序列構建的系統發育樹

乳桿菌、片球菌是醬油發酵中的常見乳酸菌。而我們的實驗卻發現魏斯氏菌在某些發酵豆制品中占有優勢地位。有報道稱魏斯氏菌可以產生某些細菌素，抑制一些革蘭氏陽性菌生長［9］，這可能是在醬油發酵的前期芽孢桿菌較少的原因之一。另外，由于在發酵25d的時候，發酵溫度上升至50℃左右，這也可能是最后只檢測到芽孢桿菌存在的原因。

3 結論

本研究通過構建16S rDNA基因文庫的方法，對2種不同種類的豆醬樣品中的原核微生物進行多樣性分析，并動態監控了醬油發酵過程中的原核微生物變化情況。研究結果表明，樣品中的乳酸菌主要以魏斯氏菌和嗜鹽四聯球菌為主，另外也有芽孢桿菌和其他一些污染菌群存在。

利用構建基因文庫的方法對自然發酵過程中微生物菌群構成進行分析，可真實、客觀地反映微生物群落的結構和多樣性，避免了傳統分離方法的片面性，對人工發酵劑的設計以及傳統發酵食品的工業化生產等方面的研究具有重要意義。

雖然構建基因文庫的方法可以較好地反映出樣品中微生物菌群的分布，但是采用這種方法對一個環境中樣品多樣性進行考察時，必須注意一些因素對研究結果造成的誤差，如由于不同微生物的細胞壁結構差異引起的細胞裂解不完全，造成DNA獲得的不均一性［10］;編碼16S rDNA的操縱子拷貝數的差異及不同DNA和PCR引物親和力不同所引起的擴增產物濃度的差異［11］等。

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Study on the prokaryotic microbial diversity of Chinese traditional fermented soybean foods

CHEN Hao1，2，FAN You1，2，CHEN Yuan-yuan1，2，ZUO Zhi-rui1，WANG Zheng-xiang1，2，*
(1.Center for Bioresource＆Bioenergy，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China; 2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The prokaryotic microbial diversities of two different soybean pastes were studied by the 16S rDNA gene libraries.In addition，the prokaryotic microbial community dynamics monitor of say sauce paste was reviewed.The results showed that Weissella cibaria，Weissella confuse，Weissella paramesenteroides and Tetragenococcus halophilus were the dominant lactic acid bacteria in samples.Bacillus，Staphylococcus，Enterobacter，Citrobacter，Pantoea，Acinetobacter and Kurthia were found in samples.

traditional fermented soybean foods;16S rDNA;microbial diversity

TS201.3

A

1002-0306(2011)09-0230-03

傳統發酵豆制品在我國有悠久的生產歷史，它們均是利用天然大豆加工而成，具有營養豐富、易于消化吸收等特點。發酵豆制品一般包括豆醬、醬油、豆豉、腐乳等食品［1］。它們的生產被認為是一個開放的、傳統的過程，其中有多種微生物參與。在此過程中發生一系列復雜的生化反應，使其發酵制品具有特定的風味、口感和營養。發酵豆制品中的微生物組成對發酵豆制品的質量有重要影響［2］。由于參與發酵的微生物種類繁多，有的對發酵有利，有的對人體有害，所以分析發酵豆制品中微生物菌群的組成，揭示微生物種類和遺傳的多樣性，對于傳統發酵食品的工業化生產、發酵調控、穩定及提高產品質量具有積極的指導意義。早期關于發酵豆制品中微生物多樣性的報道基本是建立在可培養(culture-dependent)的方法之上的，這種方法僅局限于在特定培養基生長出來的微生物，而大部分的微生物卻不能通過實驗室的純培養獲得［3］。本研究利用構建16S rDNA基因文庫方法，對2種不同種類豆醬樣品中的原核微生物進行多樣性分析，并全程監控了醬油發酵過程中的原核微生物變化情況。構建基因文庫可以把單一的目的基因克隆到載體上，被檢測出的微生物菌群可以精確到種的水平上，而且根據測序得到不同轉化子的數量比例，可以揭示出樣品中的優勢微生物菌群［4］。

2010-09-19 *通訊聯系人

陳浩(1985-)，男，在讀碩士，研究方向:微生物資源。

微生物資源國家級平臺資助項目(2005DKA21208)。