油茶果殼鞣質提取工藝及降血糖功能研究

戴甜甜，沈建福

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310029)

油茶果殼鞣質提取工藝及降血糖功能研究

戴甜甜，沈建福*

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310029)

目的:研究油茶果殼鞣質的提取工藝及降血糖功能。方法:以紫外分光光度法測定含量，采用正交設計實驗優化油茶果殼中鞣質的提取工藝。油茶果殼鞣質制備后，以400mg/(kg·d)的劑量灌胃。結果:確定優化工藝為:超聲輔助提取80min，固液比1∶20，乙醇濃度50%，油茶果殼中鞣質含量為6.75%。油茶果殼鞣質可明顯降低糖尿病小鼠空腹血糖。結論:優化工藝條件可以有效提取油茶果殼中的鞣質，工藝操作簡單合理。油茶果殼鞣質是潛在的降糖功能因子。

油茶果殼，鞣質，提取工藝，降血糖

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶果殼 品種為普通白花油茶，取自浙江省常山縣芳村鎮;沒食子酸對照品、鎢酸鈉 AR，國藥集團化學試劑有限公司;鉬酸鈉 AR，合肥科華精細化工研究所;硫酸鋰 99%，上海山海工學團實驗工廠;無水碳酸鈉 AR，太倉美達試劑有限公司;干酪素 杭州微生物試劑有限公司;磷酸 ≥85%，國藥集團化學試劑有限公司;鹽酸 AR，蘭溪市六洞山化工試劑廠;無水乙醇 AR，國藥集團化學試劑有限公司;實驗室用水 均為蒸餾水;ICR小鼠 60只，雄性，由浙江大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號:SCXK(浙)2007-0029;阿卡波糖 規格50mg/片，批號:091023，拜耳醫藥保健有限公司;葡萄糖測定試劑盒 葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法，批號20091216，上海榮盛生物藥業有限公司。

5424離心機 德國 Eppendorf股份公司; Varioskan Flash酶標儀 Thermo公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;RE-52AAA旋轉蒸發器 上海嘉鵬科技有限公司;SHB-ⅢA循環水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設備有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;BS124S萬分之一天平 Sartorius公司; KQ-300DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;電動粉碎機 溫嶺市大德中藥機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油茶果殼鞣質提取的步驟 油茶果殼→曬干→粉碎→溶劑浸泡→超聲波輔助提取→抽濾→定容→定量分析

1.2.2 鞣質含量測定［11-12］

1.2.2.1 溶液的制備 磷鉬鎢酸試液:取鎢酸鈉100g和鉬酸鈉25g，加水700mL使之溶解，加鹽酸100mL和磷酸50mL，加熱回流10h，加硫酸鋰150g，水50mL和溴數滴，煮沸除去過多的溴(溶液由棕紅色漸變為黃色)，放冷，加水稀釋至1000mL，過濾。

29%碳酸鈉試液:準確稱取145g碳酸鈉，加蒸餾水定容至500mL容量瓶中。

對照品溶液:精密稱取沒食子酸對照品50mg，置于100mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5mL，置于50mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得0.05mg/mL的沒食子酸標準溶液。

1.2.2.2 線性關系考察 精密量取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于25mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1mL，再分別加入水11.5、11.0、10.5、10.0、9.0、8.0、7.0mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應的試劑為空白，采用紫外分光光度法在760nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。其回歸方程為Y=102.17X-0.1199，R2=0.9997(n=6)，在0.01～0.001mg/mL范圍線性關系良好。

1.2.2.3 供試品溶液制備 準確稱取油茶果殼粉10.0g于250mL三角燒瓶中，按料液比加入一定量的乙醇，采用超聲波輔助萃取不同時間后，趁熱減壓抽濾，用相應濃度的乙醇溶液定容至250mL容量瓶中，作為供試品溶液。

1.2.2.4 樣品含量測定 總酚量:精密吸取供試品溶液20mL，至100mL棕色容量瓶中，得待測液。精密吸取待測液0.5mL，按照1.2.2.2項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出供試品中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。

不被吸附的多酚量:精密量取待測液25mL，加至已盛有干酪素0.6g的100mL具塞錐形瓶中，密塞，至30℃水浴中保溫1h，時時振搖。取出，放冷，搖勻，濾過，精密吸取濾液2mL，置25mL棕色量瓶中，按照1.2.2.2項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出供試品中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。

含量計算:鞣質含量=總酚量-不被吸附的多酚量

油茶果殼鞣質含量計算公式:

式中:R為油茶果殼鞣質的含量(%)，C為根據沒食子酸標準曲線公式計算出的所測樣品沒食子酸的濃度(mg/mL)，V為樣品體積(mL)，K為稀釋倍數，W為油茶果殼粉質量(mg)

1.2.3 提取工藝研究 以乙醇為溶劑采用超聲波輔助法提取油茶果殼中的鞣質，影響鞣質含量的主要因素包括乙醇濃度、超聲提取時間和乙醇用量。為了得到優化的工藝參數，采用L9(33)的正交實驗表，在前期單因素實驗的基礎上確定的實驗因素和水平如表1所示。

表1 提取參數正交實驗因素水平表

1.2.4 降血糖動物實驗

1.2.4.1 油茶果殼鞣質制備 油茶果殼在優化工藝條件下經超聲波輔助提取后，噴霧干燥，得到油茶果殼鞣質粗提物(CPT)。

1.2.4.2 糖尿病小鼠實驗［13-15］ICR小鼠適應性飼養3d后禁食(不禁水)8h，鏈尿佐菌素150mg/kg腹腔注射，注射容積0.1mL/10g，7d后禁食12h，剪尾取血測空腹血糖，根據血糖值隨機分為3組，分別為模型組、陽性對照組(阿卡波糖300mg/kg)、油茶果殼鞣質粗提物(CPT)組(400mg/kg)，每組動物數6只。每天定時灌胃給藥，給藥容積0.1mL/10g，連續給藥8d后，禁食(不禁水)12h，末次給藥1h后剪尾取血，離心分離血清，測空腹血糖。隔日進行糖耐量實驗，小鼠禁食(不禁水)12h，末次給藥1h后測空腹血糖，再灌胃給予葡萄糖2g/kg，分別于給葡萄糖后0.5、1、2h剪尾取血，離心分離血清，測血糖值。

2 結果與分析

2.1 提取工藝研究結果

超聲波提取在天然產物有效成分提取方面有著突出的作用［16］。超聲波能有效地打破細胞邊界層，使擴散速度增加，提高破碎速度，從而縮短了破碎時間，可顯著提高提取率。同時在浸提過程中不發生化學反應，不破壞所提取生物活性物質的相關活性。

實驗以油茶果殼鞣質含量為指標，其值越高越好。正交實驗結果見表2。由表2對結果進行極差分析可得，各因素的主次順序為:提取時間＞固液比＞乙醇濃度。優化的工藝條件組合為:A3B2C3，即超聲輔助提取80min，乙醇濃度50%，固液比1∶20。經驗證實驗可知，在這一條件下油茶果殼鞣質的含量可達6.75%±0.04%。

表4 油茶果殼鞣質粗提物(CPT)對鏈尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影響(s)

表4 油茶果殼鞣質粗提物(CPT)對鏈尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影響(s)

注:*表示與模型組比較p＜0.05，＊＊表示與模型組比較p＜0.01。

組別 血糖值(mmol/L) 0 30min 1h 2h AUC (mmol/L·min) 抑制率(%) 445.0±237.1 -阿卡波糖 4.62±3.13＊＊ 12.32±4.39* 3.87±3.09 1.65±3.50* 662.3±391.9* 54.17 CPT 11.75±7.07 18.37±7.01 8.27±5.93 6.58±8.模型組 15.64±2.97 19.80±2.30 7.78±2.97 8.89±4.33 1 33 1267.7±761.8 12.27

表2 油茶果殼超聲提取工藝參數正交實驗方案及結果的極差分析

2.2 降血糖動物實驗結果

2.2.1 油茶果殼鞣質粗提物(CPT)對鏈尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影響 與模型組比較，陽性對照阿卡波糖組與油茶果殼鞣質粗提物(CPT)組空腹血糖值均有明顯的降低，并有顯著性差異(p＜0.01)，血糖下降百分率分別為65.1%和38.5%，實驗結果見表3。

表3 油茶果殼鞣質粗提物(CPT)對鏈尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影響(s)

表3 油茶果殼鞣質粗提物(CPT)對鏈尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影響(s)

注:＊＊表示與模型組比較p＜0.01。

組別 血糖值(mmol/L)血糖下降給藥前 給藥后 百分率(%)模型組26.21±5.41 23.18±4.37 11 19.44±5.55 6.34±3.4465.1 38.5阿卡波糖 ＊＊CPT 19.77±6.34 13.37±3.31＊＊

2.2.2 油茶果殼鞣質粗提物(CPT)對鏈尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影響 與模型組比較，陽性對照阿卡波糖組0、0.5、2h時刻點的血糖值有明顯降低，并有顯著性差異(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.05)，油茶果殼鞣質粗提物(CPT)組的降糖作用不明顯。曲線下面積(AUC)，陽性對照阿卡波糖組較模型組有降低，并有顯著性差異(p＜0.05)。陽性對照阿卡波糖組與油茶果殼鞣質粗提物(CPT)抑制率分別為54.17%和12.27%，結果見表4。

3 結論

通過對油茶果殼鞣質的超聲波輔助提取方法及工藝的研究，在單因素實驗的基礎上，用正交實驗安排實驗方案，結果得出以油茶果殼鞣質含量為指標，影響其值高低的各因素按主次順序依次為:提取時間＞固液比＞乙醇濃度，并且得到了一組優化的工藝參數:超聲輔助提取80min，固液比1∶20，乙醇濃度50%。

本實驗研究了油茶果殼鞣質粗提物的降血糖作用，初步結果顯示:油茶果殼鞣質粗提物能降低鏈尿佐菌素糖尿病小鼠的血糖值，與模型組相比，有顯著性差異。但對葡萄糖糖耐量的作用不明顯。分析其原因可能是鞣質的結構較為特殊，其作用特點一方面是通過與消化道內的許多酶作用，特別是對α-葡萄糖苷酶的活性抑制［17］，從而調控了機體對葡萄糖等成分的吸收，起到降低血糖的作用;另一方面可能通過調控體內6-磷酸葡萄糖激酶、蛋白酪氨酸磷酸酯酶、琥珀酸脫氫酶等的活性，加快血液中葡萄糖的利用。油茶果殼鞣質的種類、結構及其降糖的機制有待進一步研究。

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Study on extraction process of tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.and hypoglycemic effect

DAI Tian-tian，SHEN Jian-fu*
(College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Objective:To determine the optimized extracting process of tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.and study its hypoglycemic effect.Method:Ultraviolet spectrophotometry was used for assay，optimized extraction conditions were adopted by using ultrasonic parameters orthogonal tests.The tannin exreacted from the shell of Camellia oleifera Abel.was given to mice at the dose of 400mg/(kg·d)(ig)and the effect on blood glucose was observed.Results:The optimized extraction conditions were 50%ethanol extracting in 20times solution for 80min.The tannin contect in the shell of Camellia oleifero Abel.was 6.75%.The fasting serum glucose in diabetic mice was reduced significantly.Conclusion:The optimized extraction process could extract the tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.efficiently and the extraction technology was simple and reasonable.It’s a protential factor for decreasing bloodsugar.

shell of Camellia oleifera Abel.;tannin;extraction technology;hypoglycemic effect

TS201.1

B

1002-0306(2011)09-0255-04

油茶(Camellia oleifera Abel.)是我國特有的木本油料樹種，目前全國種植面積約為400萬hm2，主要分布在湖南、江西、廣西、浙江、福建、安徽和貴州等地。我國對油茶的利用主要集中在將油茶籽進行榨油，油茶籽粕提取皂素等，而占油茶果總重量近60%的油茶果殼基本被廢棄或焚燒處理，造成資源浪費和環境污染。前期報道指出，油茶果殼含有大量的木質素、多縮戊糖、蛋白質和皂素等化學成分［1］，可以用來生產栲膠、糠醛、木糖醇、活性炭等，并且油茶果殼的提取物有很強的抗氧化能力。鈕炎星等的研究也表明油茶果皮含有大量的鞣質和皂苷類成分(《中國糧食學會油脂專業分會第十四屆學術年會論文選集》)。近年來，鞣質類化合物作為一類新的活性物質，其研究日益受到人們的重視。這主要是由于其具有多方面的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗脂質過氧化［2-7］等作用。鞣質中表現化學及生理活性的主要活性基團是多酚羥基結構及其沒食子酰［8］。可水解鞣質的活性依據沒食子酰基或HHDP基的數量增多而增強，縮合鞣質則依據縮合程度的提高而增強。約有70%以上的中草藥中含有鞣質類化合物。經毒理及藥效學研究結果表示，此類化合物具有明顯的抗炎、止痛、止血、抗突變等功效，并且具有低毒、安全的特點，因此具有良好的新藥開發價值［9］。沈忠明［10］研究了虎杖鞣質對小鼠的降血糖作用，在同等劑量(100mg/(kg·d))條件下，虎杖鞣質可使小鼠血糖降至6.85mmol/L，低于拜糖平(8.32mmol/L)。

2010-09-13 *通訊聯系人

戴甜甜(1985-)，女，碩士研究生，研究方向:油茶副產物的加工利用。

國家自然科學基金(30872056)。