甲殼素固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

孫 倩，李開雄，李 春，段海燕，葉 海，曹 紅，*

(1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000; 2.石河子大學化學化工學院/化工綠色過程新疆兵團重點實驗室，新疆石河子832000)

甲殼素固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

孫 倩1，李開雄1，李 春2，段海燕2，葉 海2，曹 紅2，*

(1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000; 2.石河子大學化學化工學院/化工綠色過程新疆兵團重點實驗室，新疆石河子832000)

以甲殼素為載體、戊二醛為交聯劑，固定β-葡萄糖醛酸苷酶，對β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化條件進行了研究，并通過正交實驗確定了酶固定的最佳條件:戊二醛濃度0.7%，交聯時間4h，吸附時間為9h，反應溫度40℃，此時酶活力回收率可達67.32%。

β-葡萄糖醛酸苷酶，甲殼素，固定化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種來源 課題組前期從土壤中篩選得到的Penicillium sp.Li-3;β-葡萄糖醛酸苷酶 實驗室自制;其他試劑和藥品 均為國產分析純;基礎產酶培養基 每升水中含甘草酸單銨鹽2g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4· 7H2O 0.01g。

紫外可見分光光度計 澳大利亞GBC公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-葡萄糖醛酸苷酶的制備 將真菌Penicillium sp.Li-3接種到80mL的基礎產酶培養基中，然后于30℃恒溫搖床(170r/min)培養120h后，發酵終點的菌體用pH 4.5的醋酸-醋酸銨緩沖液洗滌、重懸后定容至50mL，于冰浴條件下超聲破碎細胞(超聲破碎條件:變幅桿末端直徑φ10，工作時間2s，間隔時間4s，全程凈超聲時間20min，輸出功率400W)。離心去除沉淀，上清液即為粗酶液。

1.2.2 β-葡萄糖醛酸苷酶的固定 稱取0.1g的甲殼素，加入體積比為0.7%的戊二醛，交聯4h后徹底水洗至洗脫液中沒有戊二醛，然后加入pH6.0、總酶活為2098U的β-葡萄糖醛酸苷酶于冰浴中攪拌1h后，放入冰箱中4℃吸附過夜。次日用蒸餾水徹底水洗，過濾干燥，即可得到固定化 β-葡萄糖醛酸苷酶［11］。

1.2.3 標準曲線的建立 精密稱取經105℃干燥3h的甘草酸單銨鹽對照品30.5mg，用50%乙醇定容于50 mL容量瓶中，使其終濃度為0.61mg·mL-1，備用。精密吸取甘草酸標準對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，分別加入蒸餾水至刻度、搖勻、定容。以50%乙醇作空白對照，在252nm波長處測定各吸光度值，繪制標準曲線，以吸光度對溶液總甘草酸的含量進行回歸分析［12］。

1.2.4 游離酶和固定化酶活力的測定

1.2.4.1 游離酶活力測定 測定方法如下:200μL粗酶液加入到800μL含有甘草酸濃度2mg·mL-1、pH為4.5的醋酸-醋酸銨緩沖溶液中，40℃條件下反應1h后，沸水浴中使酶失活，取0.25mL反應液用50%乙醇定容至10mL，搖勻，在252nm下測定吸光度。空白對照只要將200μL粗酶液用相同體積煮沸失活的酶來代替，其余步驟相同。甘草酸的含量可根據甘草酸的標準曲線求得［12］。用空白對照中的甘草酸含量減去反應液中甘草酸量便可得消耗的甘草酸量。

β-葡萄糖醛酸苷酶的活力(U):在上述條件下，1mL酶液每小時分解消耗1μg甘草酸的量定義為一個酶活力單位。

1.2.4.2 固定化酶活力測定 固定化酶活力的測定將200μL粗酶液用200μL蒸餾水和一定量的固定化酶來代替，其余步驟相同。

固定化酶的相對酶活力，指在同組實驗中以活性最高的為100，與其余的固定化酶活力之比，以百分數表示。

酶活力回收率(%)=(固定化酶活力/投入的游離酶活力)×100%

2 結果與討論

2.1 標準曲線

通過測定的吸光度值，以吸光度對溶液中甘草酸濃度進行回歸分析。經線性回歸，得甘草酸對照品濃度Y(mg·mL-1)與吸光度(A)之間的線性回歸方程:Y=0.0764X-0.0003，R2=0.9999。結果表明甘草酸在0.0122～0.0610mg·mL-1濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系。標準曲線如圖1所示。

圖1 甘草酸對照品標準曲線

2.2 各種因素對固定化β－葡萄糖醛酸苷酶的影響

2.2.1 戊二醛濃度對酶活力的影響 稱取0.1g的甲殼素，分別加入濃度0.3%～0.9%的戊二醛溶液，后續步驟見1.2.2。由圖2可知，當戊二醛濃度為0.7%時，固定化酶的相對酶活力最高。戊二醛濃度較高或較低時酶活均比較低。這是因為戊二醛既是交聯劑，又是酶的變性劑。過低濃度的戊二醛使得酶交聯到載體上的程度不夠，所以酶的相對酶活力不高。但過高濃度的戊二醛會使載體交聯度過大，形成的網絡結構太緊密而限制了底物和反應產物的擴散，使得酶活性降低;同時，過高濃度的戊二醛會與酶蛋白產生過度交聯，導致活性中心的改變而使酶失活。因此，戊二醛濃度以0.70%最佳。

圖2 戊二醛濃度對固定化酶相對酶活力的影響

2.2.2 戊二醛與甲殼素交聯時間對酶活力的影響由圖3可知，當戊二醛與甲殼素的交聯時間為4h時，固定化酶的相對酶活力達到最大值。這主要是因為交聯的時間越長，交聯的戊二醛量越多，最后固定化的酶量也越多。因此，交聯時間以4h為最佳。

圖3 交聯時間對固定化酶相對酶活力的影響

2.2.3 酶吸附時間對酶活力的影響 分別選擇不同的吸附時間3～10h，間隔1h測定固定化酶活力，從而確定不同的吸附時間對固定化酶相對酶活力的影響。由圖4可知，雖然固定化酶活力在吸附5h時酶活力較高，但隨著時間的推移，酶活力又開始下降，也就是說在這個時間段內酶蛋白與載體吸附并沒有達到穩定，而在8h后載體固化能力才達到穩定，因此，選取吸附時間為8h。

圖4 吸附時間對固定化酶相對酶活力的影響

2.2.4 固定化酶與底物反應溫度對酶活力的影響分別選擇不同的反應溫度使固定化酶與底物反應，結果發現，當溫度為40℃時，固定化酶的相對酶活力最高，而隨著溫度的逐漸升高，相對酶活力急劇下降。這是因為溫度過高導致大部分酶活力喪失。因此，反應溫度以40℃為最佳。

圖5 反應溫度對固定化酶相對酶活力的影響

2.2.5 β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化 根據單因素實驗所得出的最佳結果，稱取0.1g的甲殼素，加入體積比為0.7%的戊二醛，交聯4h后徹底水洗至洗脫液中沒有戊二醛，然后加入pH6.0、總酶活為2098U的β-葡萄糖醛酸苷酶于冰浴中攪拌1h后，放入冰箱中4℃吸附8h，然后用蒸餾水徹底水洗，過濾干燥，得到固定化酶的酶活回收率為59.86%。

2.3 固定化β－葡萄糖醛酸苷酶的正交實驗

通過對酶固定化條件的單因素實驗，得出影響酶固定化的4個主要因素:戊二醛濃度、吸附時間、交聯時間、反應溫度(加酶量為2098U)。分別選取三個水平進行L9(34)正交實驗。結果見表1和表2。

表1 正交實驗因素和水平表

由表2可看出，A、C因素顯著，B和D均為不顯著因素，各因素對實驗指標影響的主次順序為:C＞A＞D＞B。由表2還可得出，最佳的工藝條件組合為A2B3C2D2，即戊二醛濃度為0.70%，交聯時間為4h，反應溫度40℃，吸附時間9h。在此條件下做驗證實驗測得固定化酶的酶活回收率可達67.32%，證明了實驗的可靠性。

3 結論

本實驗以甲殼素為載體，通過單因素實驗發現，固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的活力受到戊二醛濃度、交聯時間、反應溫度以及吸附時間的影響，后又通過正交實驗得出最佳固定化條件為:戊二醛濃度為0.7%，交聯時間為4h，反應溫度40℃，吸附時間9h，此時固定化酶的酶活回收率可達67.32%。

表2 正交實驗設計及結果

本實驗還發現，以甲殼素為載體，固定化β-葡萄糖醛酸苷酶，過程簡單，條件溫和，酶活回收率較高，并且載體甲殼素來源廣泛，價格低廉，安全無毒，為固定化β-葡萄糖醛酸苷酶生物轉化甘草酸合成GAMG的新工藝研究奠定了良好的基礎，具有一定的實用意義。

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Study on immobilization of β-glucuronidase by chitin

SUN Qian1，LI Kai-xiong1，LI Chun2，DUAN Hai-yan2，YE Hai2，CAO Hong2，*
(1.Food College，Shihezi University，Shihezi 832000，China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineer/Xinjiang Bingtuan Key Laboratory for Green Processing of Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi 832000，China)

The method of immobilized β-glucuronidase was studied in this paper，β-glucuronidase has been immobilized on chitin with glutaraldehyde as crosslinking agent.Some factors that had effect on activity of immobilized β-glucuronidase were studied.The optimal conditions of immobilization were achieved by using the method of orthogonal test，when glutaraldehyde concentration was 0.7%，cross-linking time was 4h，adsorption time was 9h and reaction temperature was 40℃，the recovery rate of immobilized β-glucuronidase activity was 67.32%.

β-glucuronidase;chitin;immobilization

TS201.2+3

B

1002-0306(2011)09-0267-04

現代研究發現，與甘草中的主要有效成分甘草酸(Glycyrrhizin，GL)相比，單葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG)的甜度更高、熱量更低，其甜度是GL的5倍多，是蔗糖的1000多倍。GAMG在體液中具有更好的溶解度和跨膜轉運能力，藥物作用起效更快;動物實驗研究表明，GAMG的LD50為5000mg/kg，遠遠大于GL的LD50(805mg/kg)，無致畸變作用［1-3］。無論作為食品添加劑，還是作為原料藥，GAMG均有望替代GL，并且可獲得相當可觀的經濟效益。因此，關于GL生物法轉化合成高生物活性(GAMG)現已成為國際上食品行業和醫藥領域的研究熱點。本課題組前期從新疆主要甘草種植區的土壤中，篩選分離到可以利用甘草酸(GL)為唯一碳源進行生長的真菌-Penicillium sp. Li-3，由該菌表達的β-葡萄糖醛酸苷酶具有較高的化學鍵選擇性，能定向催化甘草酸生成GAMG［4-8］，其摩爾轉化率可達到88.45%［9］。但在后續研究中發現，游離β-葡萄糖醛酸苷酶的穩定性較差，易失活，并且反應后混入催化產物，純化困難，不能重復使用。本文研究固定化β-葡萄糖醛酸苷酶制備技術能夠有效彌補游離酶存在的這些不足。甲殼素是一種天然氨基多糖，是甲殼類動物殼的主要成分。據估計它在生物圈合成與分解一年可達1×106t，是世界上產量最豐富的、可再生的有機資源之一［10］。由于甲殼素的特性和環保性，使其成為較好的酶固定化載體材料，而且酶經固定化后耐酸堿性強，耐熱性好，酶活不受金屬離子干擾，同時減輕對環境的污染，近年來，國際上也十分重視對這一資源的開發和利用，因此具有良好的發展前景。

2010-09-09 *通訊聯系人

孫倩(1985-)，女，碩士，研究方向:生物技術與酶工程。

教育部科學技術研究重點項目(209146);兵團博士資金項目(2009JC13);2008年度石河子大學高層次人才科研啟動資金專項(RCZX200805)。